CLU-His蛋白對(duì)Aβ寡聚化影響的單分子動(dòng)力學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)俗稱老年性癡呆，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種常見的神經(jīng)退行性疾病，以細(xì)胞外老年斑(Senile plaques，SPs)和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles，NFTs)為主要病理特征。以Aβ的胞外聚集為核心的Aβ假說仍是當(dāng)前公認(rèn)度最高的AD發(fā)病機(jī)制學(xué)說，其中Aβ寡聚體，被認(rèn)為是主要的致病因子。Clusterin蛋白作為Aβ的胞外分子伴侶，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)

2、中均已被證實(shí)與Aβ有直接相互作用關(guān)系，但二者之間相互作用機(jī)制尚不明確，且目前報(bào)道的研究結(jié)果也多有矛盾觀點(diǎn)。因此，研究clusterin與Aβ寡聚體間的相互作用并探討其作用機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步揭示AD的發(fā)病機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的臨床干預(yù)措施都有重要意義。
　　雙色熒光交叉關(guān)聯(lián)光譜(Dual color-fluorescence cross correlation spectroscopy，DC-FCCS)是通過測(cè)量熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的漲落而進(jìn)行分析檢

3、測(cè)的單分子熒光檢測(cè)技術(shù)。DC-FCCS可檢測(cè)兩種不同的熒光組分，非常適合于生物大分子間相互作用的研究，應(yīng)用DC-FCCS技術(shù)在單分子層面探討clusterin與Aβ寡聚體間的相互作用機(jī)制研究是我們首次提出。在本論文中，我們建立了相較于前期工作更為簡(jiǎn)單的熒光檢測(cè)平臺(tái)，構(gòu)建了不攜帶熒光標(biāo)簽的CLU-His蛋白，并且CLU-His蛋白也無需體外熒光標(biāo)記，只需將CLU-His蛋白與兩種不同熒光標(biāo)記的Aβ42單體孵育，即可采用DC-FCCS技術(shù)對(duì)

4、CLU-His與Aβ42間相互作用的動(dòng)力學(xué)行為進(jìn)行觀察。
　　本論文采用Bac-To-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行CLU-His蛋白的真核表達(dá)，擴(kuò)增clusterin編碼序列，然后將其連接到pFastBac1載體上，并在C端連接His標(biāo)簽編碼序列，獲得pFastBac1-CLU-His質(zhì)粒;將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli DH10Bac感受態(tài)獲得重組DNA分子rB acmid-CL U-His;之后將rBacmid-CLU-His轉(zhuǎn)染Sf

5、9細(xì)胞，包裝病毒并擴(kuò)增，過表達(dá)CLU-His蛋白;CLU-His蛋白經(jīng)鎳柱和凝膠過濾兩步柱層析純化后，與分別標(biāo)記Bodipy FL和ATTO647N兩種熒光染料的Aβ42單體，共同孵育，應(yīng)用DC-FCCS監(jiān)測(cè)CLU-His與Aβ42間相互作用的動(dòng)力學(xué)行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Aβ42寡聚體和CLU-His之間有直接的相互作用;并且隨著時(shí)間推移，二者的結(jié)合效率均逐漸增強(qiáng);CLU-His對(duì)Aβ42寡聚體的形成具有明顯的促進(jìn)作用。
　　本論文