單分子熒光檢測系統(tǒng)的搭建及蛋白相互作用動力學的研究.pdf

1、生命本質(zhì)的科學研究和逐步探索對傳統(tǒng)分析提出了新的要求，利用傳統(tǒng)的分子群體檢測技術(shù)難以對復雜的生物學反應做出解釋。單分子檢測（SMD）則可以對體系中的單個分子進行研究，通過分析其物理量隨時間的變化關(guān)系，獲得單個分子特性、分布狀態(tài)以及特定變化的過程等。單分子檢測已經(jīng)成為生物物理學、分子生物學、物理化學、生物醫(yī)學以及納米材料與科學等許多科研領(lǐng)域的重要手段。目前，單分子熒光光譜技術(shù)已被廣泛的應用于觀察核酸和蛋白質(zhì)等大分子的動態(tài)相互作用、跟蹤單個

2、粒子的微納米級位移以及識別多亞基體系的旋轉(zhuǎn)運動等動態(tài)過程，結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)則可以用來研究生物分子動力學構(gòu)象變化和相互作用的動力學過程。
　　蛋白-蛋白相互作用的研究對于揭示細胞的功能調(diào)控機制及疾病治療等方面具有重要的科學意義。但蛋白識別和分離過程中的構(gòu)象變化多發(fā)生在秒、毫秒甚至微秒時域，且表現(xiàn)為時間和空間上的動態(tài)學不均勻性。本論文以自行搭建的單分子雙通道全內(nèi)反射熒光顯微(TIRFM)為主要研究手段、以植物谷胱甘

3、肽過氧化物酶(GPX)和硫氧還蛋白(TRX)為研究體系，實時研究GPX和TRX的相互作用以及蛋白構(gòu)象動力學在其中的調(diào)控功能。具體工作如下：
　　1.單分子熒光動力學測試系統(tǒng)的搭建：根據(jù)論文的工作設(shè)計和安排，我們自行設(shè)計并搭建了雙通道全內(nèi)反射熒光顯微鏡系統(tǒng)，使其同時具有單分子FRET和單分子跟蹤及動力學分析的功能。論文詳細介紹了該裝置的搭建思路和過程，包括各個儀器配件的選擇和調(diào)試；通過對雙熒光標記 DNA的測試分析和檢驗，實現(xiàn)了整個

4、系統(tǒng)的性能優(yōu)化，為之后在單分子水平上研究蛋白相互作用的動力學過程打下了基礎(chǔ)。
　　2.擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶（AtGPX3）和硫氧還蛋白（AtTRX9）的相互作用研究：我們利用已經(jīng)搭建的 TIRFM系統(tǒng)，結(jié)合單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，以擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶（AtGPX3）和硫氧還蛋白（AtTRX9）為研究體系，對AtGPX3和AtTRX9之間的蛋白相互作用過程進行了研究。在體相上，通過熒光標記蛋白和熒光光譜技術(shù)，觀測到了兩

5、種作用蛋白之間存在明顯的FRET現(xiàn)象，證實了AtGPX3和AtTRX9之間存在相互作用。在單分子水平上，利用 TIRFM系統(tǒng)對標記后的AtGPX3和AtTRX9相互作用過程中供體和受體的強度變化進行實時檢測，并將計算所得的smFRET效率進行統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩種蛋白進行電子交換之后，二者之間的FRET效率呈現(xiàn)三種分布，特別是FRET效率從最高到最低之間存在一個明顯的中間態(tài)；該中間態(tài)主要有兩種不同的效率值，0.8和0.4，分別對應于

6、兩個蛋白分離過程中的兩種不同空間距離；而 FRET的非零最小值表明AtGPX3和AtTRX9蛋白相互作用后并沒有完全分離。通過對兩種作用蛋白的氨基酸序列及晶體結(jié)構(gòu)分析，認為在兩蛋白相互作用的過程中可能存在兩種電子轉(zhuǎn)移方式以及二硫鍵的形成模式。
　　總之，本論文工作包括自行搭建了TIRFM系統(tǒng)，并利用單分子熒光技術(shù)對AtGPX3和AtTRX9之間的相互作用過程進行了實時的觀測和研究，獲得了AtGPX3和AtTRX9分離過程中蛋白構(gòu)象