ROCK表達(dá)下調(diào)對(duì)PDGF介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移、增殖的調(diào)控.pdf

1、目的:血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)從中膜向內(nèi)膜下間隙的遷移和過(guò)度增生是高血壓、血管成形術(shù)后再狹窄和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)為一種較強(qiáng)的促有絲分裂劑,且具有趨化活性,其靶細(xì)胞主要是VSMC。PDGF-BB亞型是現(xiàn)已知VSMC最強(qiáng)體外趨化劑,介導(dǎo)VSMC遷移及增殖。影響V

2、SMC遷移與增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路很多,其中Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的ROCK通過(guò)影響下游蛋白分子磷酸化水平,以及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá),從而影響VSMC的遷移和增殖。ROCK有2種亞型,分別為ROCKⅠ和ROCKⅡ,二者氨基酸序列的同源性為65％,激酶區(qū)同源性則高達(dá)92%。因此,一般學(xué)者認(rèn)為二者在細(xì)胞內(nèi)功能相同。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn),在某些細(xì)胞中ROCKⅠ和ROCKⅡ具有不同細(xì)胞功能。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)為轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)到胞

3、內(nèi),影響細(xì)胞增殖和遷移等生物學(xué)行為的一類重要信號(hào)系統(tǒng)。現(xiàn)已知真核細(xì)胞中主要的MAPK通路包括JNK通路,ERK1/2通路,p38 MAPK通路及ERK5通路。新近研究表明p38 MAPK參與活體動(dòng)物血管損傷后的動(dòng)脈再狹窄過(guò)程,且ERK1/2通路與細(xì)胞遷移和增殖密切相關(guān)。兩者在血管損傷后的動(dòng)脈再狹窄過(guò)程中具有協(xié)同作用。目前,ROCK兩種亞型在VSMC的遷移和增殖中的作用是否一致尚不清楚。本課題旨在研究ROCK亞型(ROCKⅠ與ROCKⅡ)

4、在大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(A7r5)遷移和增殖中的作用及其分子機(jī)制。
　　 方法:(1)利用siRNA干擾技術(shù),通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ROCKⅠ和ROCKⅡ的siRNA,使ROCKⅠ和ROCKⅡ基因表達(dá)分別下調(diào),檢測(cè)基因表達(dá)下調(diào)后蛋白的表達(dá)水平。(2)利用免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)MAPK通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平及細(xì)胞周期相關(guān)因子的表達(dá)。(3)利用Boyden Chamber法,觀察ROCKⅠ和ROCKⅡ基因表達(dá)下調(diào)后以

5、及ROCK特異抑制劑Y-27632對(duì)PDGF誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞遷移的影響。(4)利用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。(5)利用細(xì)胞流式分析技術(shù),通過(guò)PI染色法分析各實(shí)驗(yàn)組在PDGF誘導(dǎo)下的細(xì)胞周期的變化。
　　 結(jié)果:(1)siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后ROCKⅠ和ROCKⅡ蛋白表達(dá)明顯下調(diào),且加入PDGF后不影響siRNA下調(diào)蛋白表達(dá)的效率。(2)ROCKⅠ表達(dá)下調(diào)和抑制劑Y27632,均抑制由PDGF誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞的遷移,而ROCKⅡ

6、表達(dá)下調(diào)后的抑制作用不明顯。(3)在胞漿中,ROCKⅠ和ROCKⅡ表達(dá)下調(diào)及Y27632處理后,PDGF介導(dǎo)的Erk1/2磷酸化水平無(wú)明顯變化;ROCKⅠ表達(dá)下調(diào)及Y27632處理組,p-p38水平無(wú)變化,而隨著ROCKⅡ表達(dá)下調(diào),p-p38水平卻有增加趨勢(shì)。(4)在核提取物中,下調(diào)ROCKⅠ和ROCKⅡ表達(dá)或Y27632及PD98059處理組的P-ERK1/2水平均降低;(5)ROCK亞型表達(dá)下調(diào)以及抑制劑Y27632均能抑制由PDG

7、F介導(dǎo)的細(xì)胞增殖;(6)ROCK亞型表達(dá)下調(diào)及抑制劑Y27632可能會(huì)抑制由PDGF引起的細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)化;(7)ROCKⅠ和ROCKⅡ表達(dá)下調(diào)及抑制劑Y27632使cyclinD1,PCNA,CDK4等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)降低。
　　 結(jié)論:(1)ROCK兩種亞型中,ROCKⅠ在VSMCs的遷移中起主導(dǎo)作用,ROCKⅡ?qū)w移的影響不明顯;(2)ROCKⅠ可以調(diào)控p-Erk1/2由胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)的移位過(guò)程,而ROCKⅡ能