Let-7d對血管平滑肌細胞增殖調(diào)控的研究.pdf

1、miRNA是一類由多細胞動物或植物基因組前體Mrna的內(nèi)含子、獨立轉(zhuǎn)錄單位或是miRNA基因簇編碼的20個左右核苷酸大小的內(nèi)源性的單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平沉默特定基因從而對生物體基因表達起到精細調(diào)節(jié)的作用。Let-7是2000年發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，細胞和活體水平試驗表明let-7作為一種腫瘤抑制基因，在細胞增殖和分化的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用，因其表達穩(wěn)定，let-7 功能失調(diào)已被作為肺癌診斷和預后的臨床標記物之一。目前l(fā)et-7對已明確的

2、靶基因主要是RAS和HMGA2,這兩種基因在缺失let-7的情況下發(fā)生功能失調(diào)。人類3種RAS（包括HRAS,KRAS和NRAS）
　　 的3’UTRs 包含多個假定的let-7 互補位點，這些互補位點表明哺乳動物let-7家族很可能調(diào)控人類RAS表達。顯然let-7通過RAS的3’UTRs 負向調(diào)控人類細胞中RAS的表達。Let-7通過作用于靶基因RAS,對RAS 途徑產(chǎn)生負向調(diào)節(jié)，腫瘤細胞表達let-7的量微乎其微，對RAS

3、蛋白的合成產(chǎn)生去抑制作用，從而促進腫瘤細胞的增殖。而RAS 也正是調(diào)控平滑肌細胞增殖、遷移和肥大的重要分子，在高血壓發(fā)病過程中起重要作用。Let-7在血管平滑肌細胞增殖過程中是否與其在腫瘤細胞中有類似重要的調(diào)控作用尚不清楚。本研究的目的是檢測let-7在高血壓大鼠和正常血壓大鼠血管平滑肌細胞中的表達差異，以及在血管平滑肌細胞中過表達let-7，探索其對血管平滑肌細胞增殖的影響，為高血壓病的治療提供新的靶點。
　　 第一部分：SH

4、R和 WKY 主動脈平滑肌細胞的原代培養(yǎng)、傳代以及兩者microRNA表達譜差異分析
　　 目的：分析 SHR和 WKY 主動脈平滑肌細胞間 microRNA的表達差異方法：1、采用組織貼片法原代培養(yǎng) SHR和 WKY 主動脈平滑肌細胞：取10周齡雄性 SHR和 WKY大鼠的主動脈中膜行組織貼片法培養(yǎng)主動脈平滑肌原代細胞，每組6只，利用α-SM-actin對培養(yǎng)出的細胞進行鑒定。2、從兩組原代細胞中提取總RNA,利用microR

5、NA芯片技術(shù)對其進行分析,篩選出表達差異譜。3、利用RT-PCR方法對表達差異兩倍以上的microRNA 進一步確認：根據(jù)microRNA的序列設(shè)計其特異性的莖環(huán)狀逆轉(zhuǎn)錄引物及PCR 擴增的前向及逆向引物，提取細胞RNA在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下先行反轉(zhuǎn)錄獲取Cdna，Cdna在特異酶及引物作用下行PCR,并在PCR 反應體系中加入熒光探針，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR 過程，最后通過標準曲線對microRNA 進行定量分析。結(jié)果：SHR

6、和 WKY 主動脈平滑肌細胞的microRNA 存在表達差異，經(jīng)過microRNA 芯片以及定量PCR 技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)在SHR 主動脈平滑肌細胞中上調(diào)2倍以上的microRNA 有：mir-92b，mir-378，mir-219-2-3p；下調(diào)2倍以上的microRNA有：let-7d，let-7f，mir-98，mir-1，mir-500,let-7a，let-7i，mir-34b等。
　　 結(jié)論：增殖能力完全不同的SHR和

7、WKY大鼠主動脈平滑肌細胞中microRNA表達譜存在明顯差異，下調(diào)顯著的是let-7d，上調(diào)顯著的有mir-92b。提示這些存在表達差異的microRNA在平滑肌細胞增殖過程中可能部分發(fā)揮作用，參與細胞的某些病理生理過程。
　　 第二部分：let-7d靶基因的預測及初步驗證
　　 目的：通過生物信息學的方法初步預測、并篩選出可能與血管平滑肌細胞增殖密切相關(guān)的microRNA的靶基因。
　　 方法：運用miRan

8、da、MiRBase、Pictar、TargetScan和BibiServ等靶基因預測軟件檢索let-7d 可能的靶向基因，篩選出保守程度較高、結(jié)合自由能較低，并且與心血管系統(tǒng)病理生理過程相關(guān)的基因作為初步候選靶基因，同時參考已發(fā)表的、高影響因子的論文，我們選定KRAS，作為研究的靶基因。
　　 結(jié)果：（1）通過不同的預測軟件，我們發(fā)現(xiàn)let-7d的多種可能靶基因，選定在心血管病理生理過程中發(fā)揮重要作用的RAS作為我們研究的目的

9、基因。（2）參考已發(fā)表的各篇高影響因子論文，根據(jù)已有報道我們認為RAS在線蟲、以及多種哺乳動物的細胞中，尤其是腫瘤細胞中是受到let-7的調(diào)控的。
　　 結(jié)論：生物信息學預測RAS 可能是let-7d的靶基因，let-7d通過作用于KRAS的3’UTR 端而起到抑制其基因表達的作用。
　　 第三部分：let-7d在血管平滑肌細胞內(nèi)與KRAS的關(guān)系研究
　　 目的:在血管平滑肌細胞中分析let-7d與KRAS表達之

10、間的調(diào)控關(guān)系方法：使用let-7d mimics 轉(zhuǎn)染SHR/WKY大鼠主動脈平滑肌細胞以及HCASMC，轉(zhuǎn)染72小時，收集細胞，然后提取總蛋白，通過Western Blot的方法觀察let-7d與KRAS 之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：在上述三種血管平滑肌細胞中高表達let-7d，KRAS的表達水平發(fā)生相應的明顯減低。結(jié)論：在血管平滑肌細胞中過表達let-7d，可以抑制KRAS的表達。推測let-7d可能是通過調(diào)節(jié)KRAS 參與了

11、血管平滑肌細胞相關(guān)疾病的病理生理過程。
　　 第四部分：let-7d對血管平滑肌細胞增殖的影響目的：利用SHR/WKY 主動脈平滑肌細胞以及HCASMC，分析let-7d 高表達對血管平滑肌細胞增殖的影響。
　　 方法：（1）在SHR/WKY 主動脈平滑肌細胞以及HCASMC中利用let-7d mimics轉(zhuǎn)染細胞，過表達let-7d，通過CCK-8 試劑盒研究轉(zhuǎn)染后48小時、72小時后細胞的增殖情況。（2）在SHR/W

12、KY 主動脈平滑肌細胞以及HCASMC中轉(zhuǎn)染let-7d mimics/陰性對照，轉(zhuǎn)染后48小時收集細胞，然后使用70％的乙醇固定1小時，用PI 染色，進行流式細胞儀檢測細胞周期，研究過表達let-7d對上述血管平滑肌細胞周期的影響。
　　 結(jié)果：（1）在血管平滑肌細胞中過表達let-7d，對于SHR-VSMCs, WKY-VSMCsand HCASMCs, 48小時的細胞增殖抑制率分別為 28.11％ (P<0.05), 18

13、.77％ (P<0.05)以及 17.32％ (P<0.01)，而72小時的細胞增殖抑制率則分別為25.19％ (P<0.05),18.53％ (P<0.01) 以及18.27％ (P<0.01)。（2）G1期的細胞比例明顯增加，分別從54.25％到 71.82％ (SHR-VSMCs, P<0.01), 71.23％ 到91.21％ (WKY-VSMCs, P<0.01)，44.13％ 到 56.81％ (HCASMCs, P<0.0

14、1)；而處于S 期的細胞比例明顯下降：從18.61％到 13.87％ (SHR-VSMCs, P<0.01), 14.58％ 到 2.27％ (WKY-VSMCs, P<0.01)，28.43％ 到18.21％ (HCASMCs, P<0.05)；另外，G2 期的細胞比例也同時下降：從27.14％ 到 14.31％ (SHR-VSMCs, P<0.01), 14.19％ 到6.51％ (WKY-VSMCs,P<0.01)，27.44％到