Let-7d對血管平滑肌細(xì)胞增殖調(diào)控的研究.pdf

1、miRNA是一類由多細(xì)胞動物或植物基因組前體Mrna的內(nèi)含子、獨立轉(zhuǎn)錄單位或是miRNA基因簇編碼的20個左右核苷酸大小的內(nèi)源性的單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平沉默特定基因從而對生物體基因表達(dá)起到精細(xì)調(diào)節(jié)的作用。Let-7是2000年發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，細(xì)胞和活體水平試驗表明let-7作為一種腫瘤抑制基因，在細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用，因其表達(dá)穩(wěn)定，let-7 功能失調(diào)已被作為肺癌診斷和預(yù)后的臨床標(biāo)記物之一。目前l(fā)et-7對已明確的

2、靶基因主要是RAS和HMGA2,這兩種基因在缺失let-7的情況下發(fā)生功能失調(diào)。人類3種RAS（包括HRAS,KRAS和NRAS）
　　 的3’UTRs 包含多個假定的let-7 互補位點，這些互補位點表明哺乳動物let-7家族很可能調(diào)控人類RAS表達(dá)。顯然let-7通過RAS的3’UTRs 負(fù)向調(diào)控人類細(xì)胞中RAS的表達(dá)。Let-7通過作用于靶基因RAS,對RAS 途徑產(chǎn)生負(fù)向調(diào)節(jié)，腫瘤細(xì)胞表達(dá)let-7的量微乎其微，對RAS

3、蛋白的合成產(chǎn)生去抑制作用，從而促進腫瘤細(xì)胞的增殖。而RAS 也正是調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和肥大的重要分子，在高血壓發(fā)病過程中起重要作用。Let-7在血管平滑肌細(xì)胞增殖過程中是否與其在腫瘤細(xì)胞中有類似重要的調(diào)控作用尚不清楚。本研究的目的是檢測let-7在高血壓大鼠和正常血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)差異，以及在血管平滑肌細(xì)胞中過表達(dá)let-7，探索其對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，為高血壓病的治療提供新的靶點。
　　 第一部分：SH

4、R和 WKY 主動脈平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代以及兩者microRNA表達(dá)譜差異分析
　　 目的：分析 SHR和 WKY 主動脈平滑肌細(xì)胞間 microRNA的表達(dá)差異方法：1、采用組織貼片法原代培養(yǎng) SHR和 WKY 主動脈平滑肌細(xì)胞：取10周齡雄性 SHR和 WKY大鼠的主動脈中膜行組織貼片法培養(yǎng)主動脈平滑肌原代細(xì)胞，每組6只，利用α-SM-actin對培養(yǎng)出的細(xì)胞進行鑒定。2、從兩組原代細(xì)胞中提取總RNA,利用microR

5、NA芯片技術(shù)對其進行分析,篩選出表達(dá)差異譜。3、利用RT-PCR方法對表達(dá)差異兩倍以上的microRNA 進一步確認(rèn)：根據(jù)microRNA的序列設(shè)計其特異性的莖環(huán)狀逆轉(zhuǎn)錄引物及PCR 擴增的前向及逆向引物，提取細(xì)胞RNA在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下先行反轉(zhuǎn)錄獲取Cdna，Cdna在特異酶及引物作用下行PCR,并在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光探針，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR 過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對microRNA 進行定量分析。結(jié)果：SHR

6、和 WKY 主動脈平滑肌細(xì)胞的microRNA 存在表達(dá)差異，經(jīng)過microRNA 芯片以及定量PCR 技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)在SHR 主動脈平滑肌細(xì)胞中上調(diào)2倍以上的microRNA 有：mir-92b，mir-378，mir-219-2-3p；下調(diào)2倍以上的microRNA有：let-7d，let-7f，mir-98，mir-1，mir-500,let-7a，let-7i，mir-34b等。
　　 結(jié)論：增殖能力完全不同的SHR和

7、WKY大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞中microRNA表達(dá)譜存在明顯差異，下調(diào)顯著的是let-7d，上調(diào)顯著的有mir-92b。提示這些存在表達(dá)差異的microRNA在平滑肌細(xì)胞增殖過程中可能部分發(fā)揮作用，參與細(xì)胞的某些病理生理過程。
　　 第二部分：let-7d靶基因的預(yù)測及初步驗證
　　 目的：通過生物信息學(xué)的方法初步預(yù)測、并篩選出可能與血管平滑肌細(xì)胞增殖密切相關(guān)的microRNA的靶基因。
　　 方法：運用miRan

8、da、MiRBase、Pictar、TargetScan和BibiServ等靶基因預(yù)測軟件檢索let-7d 可能的靶向基因，篩選出保守程度較高、結(jié)合自由能較低，并且與心血管系統(tǒng)病理生理過程相關(guān)的基因作為初步候選靶基因，同時參考已發(fā)表的、高影響因子的論文，我們選定KRAS，作為研究的靶基因。
　　 結(jié)果：（1）通過不同的預(yù)測軟件，我們發(fā)現(xiàn)let-7d的多種可能靶基因，選定在心血管病理生理過程中發(fā)揮重要作用的RAS作為我們研究的目的

9、基因。（2）參考已發(fā)表的各篇高影響因子論文，根據(jù)已有報道我們認(rèn)為RAS在線蟲、以及多種哺乳動物的細(xì)胞中，尤其是腫瘤細(xì)胞中是受到let-7的調(diào)控的。
　　 結(jié)論：生物信息學(xué)預(yù)測RAS 可能是let-7d的靶基因，let-7d通過作用于KRAS的3’UTR 端而起到抑制其基因表達(dá)的作用。
　　 第三部分：let-7d在血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)與KRAS的關(guān)系研究
　　 目的:在血管平滑肌細(xì)胞中分析let-7d與KRAS表達(dá)之

10、間的調(diào)控關(guān)系方法：使用let-7d mimics 轉(zhuǎn)染SHR/WKY大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞以及HCASMC，轉(zhuǎn)染72小時，收集細(xì)胞，然后提取總蛋白，通過Western Blot的方法觀察let-7d與KRAS 之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：在上述三種血管平滑肌細(xì)胞中高表達(dá)let-7d，KRAS的表達(dá)水平發(fā)生相應(yīng)的明顯減低。結(jié)論：在血管平滑肌細(xì)胞中過表達(dá)let-7d，可以抑制KRAS的表達(dá)。推測let-7d可能是通過調(diào)節(jié)KRAS 參與了

11、血管平滑肌細(xì)胞相關(guān)疾病的病理生理過程。
　　 第四部分：let-7d對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響目的：利用SHR/WKY 主動脈平滑肌細(xì)胞以及HCASMC，分析let-7d 高表達(dá)對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響。
　　 方法：（1）在SHR/WKY 主動脈平滑肌細(xì)胞以及HCASMC中利用let-7d mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞，過表達(dá)let-7d，通過CCK-8 試劑盒研究轉(zhuǎn)染后48小時、72小時后細(xì)胞的增殖情況。（2）在SHR/W

12、KY 主動脈平滑肌細(xì)胞以及HCASMC中轉(zhuǎn)染let-7d mimics/陰性對照，轉(zhuǎn)染后48小時收集細(xì)胞，然后使用70％的乙醇固定1小時，用PI 染色，進行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，研究過表達(dá)let-7d對上述血管平滑肌細(xì)胞周期的影響。
　　 結(jié)果：（1）在血管平滑肌細(xì)胞中過表達(dá)let-7d，對于SHR-VSMCs, WKY-VSMCsand HCASMCs, 48小時的細(xì)胞增殖抑制率分別為 28.11％ (P<0.05), 18

13、.77％ (P<0.05)以及 17.32％ (P<0.01)，而72小時的細(xì)胞增殖抑制率則分別為25.19％ (P<0.05),18.53％ (P<0.01) 以及18.27％ (P<0.01)。（2）G1期的細(xì)胞比例明顯增加，分別從54.25％到 71.82％ (SHR-VSMCs, P<0.01), 71.23％ 到91.21％ (WKY-VSMCs, P<0.01)，44.13％ 到 56.81％ (HCASMCs, P<0.0

14、1)；而處于S 期的細(xì)胞比例明顯下降：從18.61％到 13.87％ (SHR-VSMCs, P<0.01), 14.58％ 到 2.27％ (WKY-VSMCs, P<0.01)，28.43％ 到18.21％ (HCASMCs, P<0.05)；另外，G2 期的細(xì)胞比例也同時下降：從27.14％ 到 14.31％ (SHR-VSMCs, P<0.01), 14.19％ 到6.51％ (WKY-VSMCs,P<0.01)，27.44％到