長期施肥對水稻土亞硝酸還原酶基因(nirK、nirS)多樣性的影響.pdf

1、反硝化作用是造成土壤氮素損失的主要途徑之一,不僅導(dǎo)致氮肥利用率降低,同時增加溫室氣體N2O的排放量,破壞大氣臭氧層,加速全球氣候變暖,對環(huán)境產(chǎn)生嚴重影響。長期施肥對稻田土壤反硝化作用有重要影響,化肥尤其是氮肥的大量投入,促進了反硝化作用,提高了N2O的排放量。以反硝化過程中的關(guān)鍵功能基因——亞硝酸還原酶編碼基因(nirK、nirS)為分子標記,探討施肥對反硝化菌群落多樣性的影響,有助于提高稻田系統(tǒng)氮素利用率,減少溫室氣體排放和環(huán)境污染,

2、為稻田生產(chǎn)力可持續(xù)性發(fā)展提供重要理論依據(jù)。
　　 本研究利用中國科學(xué)院桃源農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗站始于1990年的長期施肥試驗,選取不施肥(CK)、施氮肥(N)、平衡施化肥(NPK)、有機肥配施化肥(NPKOM)四種不同施肥處理的土壤樣品,利用分子生物學(xué)技術(shù),研究了不同施肥處理對水稻土亞硝酸還原酶基因nirK、nirS多樣性的影響。研究通過設(shè)計簡并引物,采用降落式PCR擴增目的基因。目的片段用pGEM-T載體連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH-5α

3、中,通過藍白斑篩選克隆進行測序。根據(jù)測序結(jié)果,構(gòu)建nirK、nirS基因克隆文庫,計算多樣性指數(shù)、繪制Chaol預(yù)測曲線,進行LIBSHUFF分析及系統(tǒng)發(fā)育分析。主要結(jié)果如下:
　　 1)長期不同施肥對土壤反硝化速率產(chǎn)生了不同影響,NPKOM處理的反硝化速率顯著高于其他三個處理,N處理次之。NPK處理的反硝化速率高于CK處理,但沒有顯著差異。
　　 2)根據(jù)Chaol預(yù)測分析,長期不同施肥對nir基因多樣性的影響不一致。

4、NPK處理比N和NPKOM處理更有利于提高含nirK基因反硝化菌群落的多樣性,而N處理使nirS基因的多樣性顯著提高。
　　 3)利用LIBSHUFF方法分析不同施肥的基因文庫差異,發(fā)現(xiàn)nirK基因四個處理間兩兩比較的差異都達到顯著水平,而nirS基因的處理間則無顯著差異。表明長期施肥明顯改變了含nirK基因的反硝化菌的群落結(jié)構(gòu),對nirS基因群落結(jié)構(gòu)影響較小。
　　 4)本研究克隆的249個nirK基因序列有232個與

5、NCBI數(shù)據(jù)庫中已知nirK基因片段相似,nirS基因克隆只有79％與已知序列相似。nirK基因序列與數(shù)據(jù)庫中未知菌種的nirK基因相似性較高,為80％～95％,平均達90.7％；而nirS基因片段與數(shù)據(jù)庫中已知的nirs基因相似度低,為72％～82％,平均為74.7％。因此無法判斷本研究克隆得到的nirK、nirS基因片段所屬的菌種。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,nirK基因的OTUs可分為8個大簇,且不同處理下的OTUs有聚集情況,表明施肥

6、改變了nirK反硝化菌群落中優(yōu)勢種的分布。大多數(shù)nirS基因克隆聚集在一個主要的大簇中,不同處理的OTUs分布則較平均,無明顯的聚集情況,顯示其群落的穩(wěn)定性。
　　 總體來說,長期不同施肥對水稻土nirK、nirS基因反硝化菌群落多樣性的影響不一致,平衡施化肥明顯提高nirK基因多樣性,單施氮肥使nirS基因多樣性達到最高,其他施肥處理對nir基因多樣性的影響不顯著。施肥明顯改變了nirK基因群落的結(jié)構(gòu)組成,但對nirS基因群落