天然產(chǎn)物Britanin的靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)及神經(jīng)保護(hù)作用研究.pdf

1、1、研究目的:
　　人體活性氧水平的不斷增加，會(huì)打破氧化還原平衡狀態(tài)，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病、組織器官損傷和自身免疫病等一系列疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。在腦缺血再灌注過程中，腦組織內(nèi)活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)水平會(huì)大量升高，進(jìn)而引起腦組織損傷。因此，通過提高機(jī)體抗氧化水平降低機(jī)體氧化應(yīng)激壓力，成為腦卒中治療的一條重要途徑。
　　Nrf2(nuclear facto

2、r erythroid2-related factor2)信號(hào)通路是機(jī)體抵抗氧化壓力的最重要途徑之一。通過激活Nrf2信號(hào)通路，可以增強(qiáng)機(jī)體抵抗氧化損傷的能力。因此，激活Nrf2信號(hào)通路成為針對(duì)多種退行性疾病和慢性疾病的治療途徑。靶向Nrf2信號(hào)通路是開發(fā)針對(duì)神經(jīng)退行性疾病和慢性疾病治療藥物的新研究方向。
　　天然產(chǎn)物來源豐富，藥理藥效開發(fā)潛能具大。回顧整個(gè)藥物研究的歷史，天然產(chǎn)物一直在其中發(fā)揮著舉足輕重的作用，貢獻(xiàn)了諸多療效明確

3、、不可或缺的藥物。天然產(chǎn)物Britanin是一個(gè)倍半萜內(nèi)酯類化合物，廣泛分布于菊科旋覆花屬植物中。本課題通過構(gòu)建體外神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，研究Britanin的神經(jīng)保護(hù)作用。為了闡明Britanin發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制，我們開展了Britanin對(duì)氧化應(yīng)激和Nrf2信號(hào)通路的調(diào)控作用的研究。期望能夠發(fā)現(xiàn)Britanin調(diào)控Nrf2通路的分子靶標(biāo)。最終，通過構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性大鼠腦缺血再灌注損傷(Middle cerebral artery occ

4、lusion，MCAO)模型，評(píng)價(jià)Britanin在體內(nèi)水平發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的能力。綜合上述系列研究，為把Britanin開發(fā)成新穎的氧化應(yīng)激相關(guān)疾病治療藥物奠定臨床前研究基礎(chǔ)。
　　2、研究方法:
　　(1)體外神經(jīng)細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建。參考目前神經(jīng)保護(hù)方面的研究進(jìn)展，構(gòu)建了兩種體外神經(jīng)細(xì)胞損傷模型。分別是高濃度谷氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型;氧和葡糖糖剝奪再補(bǔ)充(oxygen-glucose deprivation fol

5、lowed by reperfusion，OGD-R)誘導(dǎo)原代皮層神經(jīng)元損傷模型。在這兩種細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，研究天然產(chǎn)物Britanin的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　(2)研究Britanin對(duì)Nrf2信號(hào)通路的調(diào)控作用。天然產(chǎn)物Britanin可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，降低氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷。本研究在原代神經(jīng)元細(xì)胞水平上，采用ARE(antioxidant response element)報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、siRNA干擾實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR

6、(Polymerase Chain Reaction)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)等方法，探究Britanin對(duì)Nrf2抗氧化信號(hào)通路的調(diào)控作用。
　　(3)驗(yàn)證Britanin與靶標(biāo)蛋白Keap1(Kelch-like ECH-associated protein1)的共價(jià)結(jié)合作用。Keap1蛋白是Nrf2蛋白的負(fù)性調(diào)控蛋白，通過結(jié)合Nrf2蛋白引起其泛素化修飾和程序性降解。本研究采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)并純化人源Keap1

7、全長蛋白及其BTB結(jié)構(gòu)域。本課題組前期研究中，設(shè)計(jì)合成了生物素化修飾的Britanin小分子探針。在體外機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)中，本研究采用小分子探針Pull-down靶標(biāo)蛋白Keap1的方法，初步確證二者之間的相互作用。為了進(jìn)一步確證Britanin與靶標(biāo)蛋白Keap1之間的結(jié)合位點(diǎn)，本研究采用LC-MS(liquid chromatograph-massspectrometer)分析方法，研究Britanin對(duì)Keap1蛋白序列中半胱氨酸的修

8、飾作用，確定共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)。為了明確Britanin與Keap1蛋白BTB結(jié)構(gòu)域的結(jié)合模式，本研究開展了Britanin與靶標(biāo)蛋白Keap1的復(fù)合物共結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。為了闡明Britanin激活Nrf2信號(hào)通路的分子機(jī)制，我們研究了Britanin對(duì)Nrf2蛋白泛素化水平的調(diào)控作用及調(diào)控機(jī)制。
　　(4)體內(nèi)構(gòu)建大鼠MCAO模型。與體外研究采用的OGD-R誘導(dǎo)原代皮層神經(jīng)元損傷模型相對(duì)應(yīng)，我們構(gòu)建了大鼠體內(nèi)MCAO模型，考察Britani

9、n在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用的能力。
　　3、研究結(jié)果:
　　通過體外神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)Britanin可以顯著的保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。在這一過程中Britanin可以顯著下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞受到損傷刺激時(shí)的ROS水平。
　　Nrf2信號(hào)通路是機(jī)體抵抗氧化壓力，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的最重要調(diào)節(jié)通路。通過報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和基因干擾實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)Britanin可以顯著激活Nrf2信號(hào)通路，提高Nrf2

10、信號(hào)通路下游抗氧化酶的表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　Keap1蛋白是Nrf2信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，可能是Britanin的作用靶標(biāo)。應(yīng)用小分子探針Pull-down實(shí)驗(yàn)，我們確證了Britanin與靶標(biāo)蛋白Keap1之間的相互作用。通過LC-MS聯(lián)用實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步找到了Britanin與Keap1之間的共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)。通過復(fù)合物共結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，我們得到了Britanin與Keap1蛋白BTB結(jié)構(gòu)域的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)，確證Britani

11、n通過邁克爾加成反應(yīng)共價(jià)結(jié)合于Keap1的151位半胱氨酸的結(jié)合模式。通過進(jìn)一步的分子機(jī)制研究，我們發(fā)現(xiàn)Britanin通過靶向Keap1蛋白，干擾了Keap1與Cul3之間的相互作用，使Cul3不能進(jìn)一步介導(dǎo)對(duì)Nrf2蛋白的泛素化修飾和蛋白酶體降解，進(jìn)而激活Nrf2信號(hào)通路。
　　應(yīng)用大鼠急性腦缺血再灌注損傷模型，我們考察了Britanin在體內(nèi)提高機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的能力。Britanin灌胃給藥可以激活Nrf

12、2通路，顯著降低腦組織梗死體積，改善行為學(xué)評(píng)分。
　　4、研究結(jié)論:
　　本課題發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物Britanin通過靶向Keap1蛋白，激活Nrf2信號(hào)通路。Britanin是一個(gè)全新的Nrf2信號(hào)通路激動(dòng)劑。通過共結(jié)晶結(jié)構(gòu)解析，揭示了Britanin與Keap1蛋白的結(jié)合模式，闡明了Britanin激活Nrf2信號(hào)通路的分子機(jī)制。通過體外神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)模型和體內(nèi)大鼠腦缺血再灌注損傷模型，我們發(fā)現(xiàn)Britanin通過激活Nrf2信