基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制的新型抗HIV-1先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn).pdf

1、艾滋病，又稱“獲得性免疫缺陷綜合征”(Acquired immune deficiencysyndrome，AIDS)，主要由1型人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virustype1，HIV-1)感染引起。由于HIV-1病毒具有高度變異性，臨床上將作用于HIV-1復(fù)制周期不同靶點(diǎn)的藥物聯(lián)合使用，稱為“高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法”(Highly activeantiretroviral therapy，HAART

2、)，但臨床治療中頻繁出現(xiàn)耐藥毒株，大大降低了該療法的療效。逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse transcriptase，RT)在HIV-1的復(fù)制周期中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，使其成為抗艾滋病藥物研發(fā)的優(yōu)選靶點(diǎn)之一。根據(jù)作用機(jī)制不同，RT抑制劑主要可分為核苷（酸）類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(Nucleos(t)ide reversetranscriptase inhibitors，N(t)RTIs)和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(Non-nucleosiderev

3、erse transcriptase inhibitors，NNRTIs)兩類，均為HAART的重要組成部分。其中，新一代NNRTIs具有高活低毒、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但臨床治療中出現(xiàn)的毒副作用、耐藥毒株以及藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)不佳等問題限制了其應(yīng)用。因此，研發(fā)作用于新結(jié)合位點(diǎn)和具有新結(jié)構(gòu)類型的HIV-1 NNRTIs，以提高抗耐藥性并優(yōu)化藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，依然是目前抗艾滋病藥物研究領(lǐng)域的重要任務(wù)。
　　由于RT結(jié)構(gòu)的柔韌性、NNRTI結(jié)合口

4、袋需要誘導(dǎo)產(chǎn)生、結(jié)合位點(diǎn)氨基酸極易發(fā)生突變等因素，使完全依賴RT結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)全新骨架的NNRTI十分困難。但是不同結(jié)構(gòu)類型的NNRTI具有類似的三維結(jié)構(gòu)模型，其藥效團(tuán)元素具有特定空間排布，體現(xiàn)了活性分子的抽象特征。與此同時(shí)，隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、X-晶體衍射技術(shù)的發(fā)展，一些具有抗耐藥性NNRTI的作用模式得以闡明，它們的結(jié)構(gòu)特征以及與靶點(diǎn)的作用模式為設(shè)計(jì)新一代NNRTI提供了極為有益的信息。在此背景下，根據(jù)NNRTI的結(jié)合模式及先導(dǎo)化合物的構(gòu)效關(guān)

5、系結(jié)論，綜合運(yùn)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息、藥物化學(xué)基本原理及計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)手段，并考慮影響NNRTI藥效學(xué)的諸因素，進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)（機(jī)制）的合理藥物設(shè)計(jì)，是發(fā)現(xiàn)新一代非核苷類抗艾滋病藥物的有效途徑。
　　本論文第二章以二芳基嘧啶(DAPY)類新一代HIV-1 NNRTI為先導(dǎo)化合物，在DAPY類經(jīng)典的“三點(diǎn)藥效團(tuán)”模型指導(dǎo)下，進(jìn)行了以下結(jié)構(gòu)修飾:1）在DAPY類先導(dǎo)化合物位于可容納區(qū)域Ⅰ的右翼取代基結(jié)構(gòu)部分，分別引入多種對(duì)水溶性和藥代動(dòng)力

6、學(xué)性質(zhì)有利的優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)片段如嗎啉和取代哌嗪等，以使抑制劑與NNIBP形成附加作用力，增強(qiáng)抑制劑與RT親和力以提高其活性和抗耐藥性，同時(shí)提高水溶性，改善藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(SeriesⅠA);2)將吲哚芳砜(IAS)類化合物中優(yōu)勢(shì)的苯磺?；我氲紻APY類化合物疏水性作用區(qū)，深入探討DAPY類衍生物在此作用區(qū)域的構(gòu)效關(guān)系(SeriesⅠB)。
　　SeriesⅠA所有目標(biāo)化合物表現(xiàn)出亞微摩爾到納摩爾的抗病毒活性(ⅢB)，介于0.20μ

7、M-0.0035μM之間，優(yōu)于上市藥物3TC(EC50=6.41μM)和NVP(EC50=0.24μM)?；钚宰詈玫氖腔衔铫馎-Ⅱ3，其抗HIV-1ⅢB活性（EC50=0.0035μM）遠(yuǎn)好于3TC和NVP，是AZT（EC50=0.011μM）的3倍，與先導(dǎo)ETR相同。ⅠA-Ⅱ3細(xì)胞毒性較低（CC50≥173μM），選擇性指數(shù)SI超過48774。并且，ⅠA-Ⅱ3還對(duì)臨床最常見的雙突變株(K103N/Y181C)表現(xiàn)出亞微摩爾的抑制活性

8、(EC50=0.79μM)，優(yōu)于NVP(＞15.0μM)，與EFV處于相同數(shù)量級(jí)(EC50=0.24μM)。此外，ⅠA-Ⅰ6（IC50=0.042μM）酶抑制活性最佳，比NVP（IC50=0.595μM）高一個(gè)數(shù)量級(jí)，與先導(dǎo)物RPV處于相同數(shù)量級(jí)（IC50=0.022μM）。ⅠA-Ⅱ3酶抑制活性也較好(IC50=0.067μM)。
　　SeriesⅠB有9個(gè)目標(biāo)化合物表現(xiàn)出中等抗HIV-1活性，EC50范圍在1.48-48.9μM

9、之間(SI=2 to80)。其中，ⅠB-Ⅰ1和ⅠB-Ⅱ1的抗HIV-1ⅢB活性最好(EC50=1.48μM和EC50=1.61μM)，遠(yuǎn)高于對(duì)照藥ddI（EC50=76.0μM），與3TC相當(dāng)(EC50=2.54μM)，但弱于先導(dǎo)RS-80（EC50=0.0026μM）和RPV（EC50=0.0013μM）。
　　水溶性測(cè)試表明，化合物ⅠA-Ⅰ6和ⅠA-Ⅱ3水溶性較先導(dǎo)物依曲韋林(ETR)大大提高，有望改善藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。本章所合

10、成的DAPY類衍生物活性結(jié)果表明，基于DAPY類先導(dǎo)物“三點(diǎn)藥效團(tuán)”模型，進(jìn)一步探討NNIBP中可容納區(qū)域Ⅰ的化學(xué)空間，增強(qiáng)抑制劑與RT作用力以保持和提高活性和抗耐藥性，思路初步驗(yàn)證可行。引入優(yōu)勢(shì)水溶性結(jié)構(gòu)片段使抑制劑溶解度大大提高，有望改善藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。但對(duì)疏水性作用區(qū)的修飾則使活性大幅下降。
　　本論文第三章以上述“三點(diǎn)藥效團(tuán)”模型為基礎(chǔ)，在ETR中心環(huán)5，6位引入第四個(gè)藥效團(tuán)元素作用于可容納區(qū)域Ⅱ，新構(gòu)建DAPY類化合物“

11、四點(diǎn)藥效團(tuán)”模型。該“四點(diǎn)藥效團(tuán)”模型具有“多位點(diǎn)結(jié)合”的作用特征，通過最大程度地占據(jù)結(jié)合口袋，可以有效增強(qiáng)DAPY類NNRTIs與RT的結(jié)合力，從而提高DAPY類化合物的活性和抗耐藥性?；谛聵?gòu)建的“四點(diǎn)藥效團(tuán)”模型，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列具有“多位點(diǎn)結(jié)合”特征的以五元或六元并六元稠環(huán)為母核的DAPY類衍生物(SeriesⅠC)和N-取代的哌啶胺結(jié)構(gòu)修飾的[1，2，4]三唑并[1，5-α]嘧啶類DAPY衍生物(SeriesⅠD)。
　

12、　體外抑酶活性結(jié)果顯示，SeriesⅠC中有17個(gè)衍生物的抑酶活性在幾十個(gè)納摩爾級(jí)，在0.014μM-0.080μM之間，比NVP高出一個(gè)數(shù)量級(jí)（IC50=0.595μM）?；钚杂葹橥怀龅暮瑯蝾^氮原子的吡咯并[2，1-f][1，2，4]三嗪類化合物ⅠC-Ⅵ2(IC50=0.014μM)，是NVP的42.5倍，比先導(dǎo)物RPV略好(IC50=0.022μM)，與先導(dǎo)物RDEA427相當(dāng)（IC50=0.016μM）。
　　細(xì)胞水平的抗病

13、毒活性結(jié)果顯示，SeriesⅠD化合物中，有12個(gè)衍生物的抗HIV-1野生毒株活性在8.1 nM-42 nM之間，多個(gè)衍生物的選擇性指數(shù)高于1000。其中，活性最為突出的ⅠD-Ⅰ4和ⅠD-Ⅰ9(EC50=8.1 nM、8.7nM)的抗HIV-1野生毒株的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于上市藥物ddI、3TC、NVP和DLV（EC50分別為23198 nM、2239nM、312 nM和540 nM），與AZT和EFV活性相當(dāng)(EC50分別為7.1 nM和6.

14、3 nM)，與ETR處于相同數(shù)量級(jí)(EC50=1.8 nM)。并且，有3個(gè)化合物ⅠD-Ⅰ2、ⅠD-Ⅰ4和ⅠD-Ⅰ5對(duì)臨床最常見的雙突變毒株RES056(K103N/Y181C)表現(xiàn)出一定的抑制活性（EC50分別為6.4μM、13μM和22μM），好于藥物DLV（EC50＞36μM）。水溶性測(cè)試表明，化合物ⅠD-Ⅰ4水溶性較ETR大大提高，有望改善藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。
　　以上活性結(jié)果表明，基于新構(gòu)建的DAPY類先導(dǎo)物“四點(diǎn)藥效團(tuán)”模型

15、，通過“多位點(diǎn)結(jié)合”，可以有效增強(qiáng)DAPY類NNRTIs與RT的結(jié)合力，從而提高DAPY類化合物的活性和抗耐藥性，設(shè)計(jì)思路驗(yàn)證合理。此外，在可容納區(qū)域Ⅰ引入取代哌啶胺結(jié)構(gòu)使化合物溶解度大大提高，有望改善藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。ⅠC-Ⅵ2和ⅠD-Ⅰ4可作為先導(dǎo)化合物進(jìn)一步優(yōu)化。
　　本論文第四章選取臨床候選藥物二苯酮類NNRTI GW678248和對(duì)K103N/Y181C RT具有很好抑制活性的吡唑類NNRTI GA-40為先導(dǎo)化合物，運(yùn)用

16、分子雜合和生物電子等排原理，提取兩個(gè)先導(dǎo)物中的優(yōu)勢(shì)片段進(jìn)行組合，設(shè)計(jì)合成了一系列吡啶氧乙酰胺類HIV-1 NNRTIs。細(xì)胞水平的抗病毒活性結(jié)果顯示，該類衍生物中僅有三個(gè)化合物ⅡA-Ⅰ1、ⅡA-Ⅰ8和ⅡA-Ⅰ10表現(xiàn)出微摩爾級(jí)的HIV-1ⅢB抑制活性（EC50=41.5μM、10.8μM和8.18μM）。盡管活性與我們預(yù)期相差較大，但是初步的構(gòu)效關(guān)系為進(jìn)一步的修飾提供了有價(jià)值的信息。
　　本論文第五章分別基于前藥和孿藥藥物設(shè)計(jì)原理

17、，設(shè)計(jì)合成了DAPY類HIV-1 NNRTI候選藥物RDEA427的磷酸酯前藥RDEA427-PB和碳酸酯前藥RDEA427-CIC以及HIV-1 NRTI上市藥物AZT與HIV NCp7抑制劑(SAMT-1b)通過二硫鍵連接的孿藥分子Ⅲ-7。體外抑酶活性結(jié)果表明，RDEA427-PB和RDEA427-CIC對(duì)HIV-1 RT有一定的抑制活性，且活性相近(IC50=0.239μM，0.264μM)，均弱于原藥RDEA427（IC50=0

18、.016μM）。RDEA427-PB和RDEA427-CIC體外活性比原藥RDEA427差一個(gè)數(shù)量級(jí)，初步驗(yàn)證了設(shè)計(jì)的合理性。RDEA427-CIC在人血漿中的半衰期大于2h，其在2h之內(nèi)可以裂解釋放出少量原藥RDEA427。我們推測(cè)RDEA427-CIC可能在釋放出羥甲基中間體后未繼續(xù)裂解，或者可能存在其他代謝位點(diǎn)和途徑。
　　AZT-NCp7抑制劑孿藥分子Ⅲ-7對(duì)HIV-1 RT有較微弱的抑制活性，IC50為128μM。雖然Ⅲ

19、-7對(duì)RT抑制活性較弱，但若進(jìn)入感染細(xì)胞內(nèi)，將在谷胱甘肽(GSH)介導(dǎo)下釋放出兩個(gè)原藥，協(xié)同發(fā)揮抗HIV作用。Ⅲ-7酶抑制活性較弱也在一定程度上說明了通過二硫鍵形成的孿藥分子設(shè)計(jì)的合理性。
　　目前，本部分研究涉及的三個(gè)目標(biāo)化合物細(xì)胞水平的抗HIV活性和RDEA427-PB血漿代謝穩(wěn)定性以及孿藥裂解機(jī)制的測(cè)試正在進(jìn)行之中。
　　本論文針對(duì)現(xiàn)有HIV-1 NNRTIs的不足，根據(jù)靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)生物學(xué)新進(jìn)展，綜合運(yùn)用藥物化學(xué)原理及計(jì)算

20、機(jī)輔助技術(shù)進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)，共合成120余個(gè)全新結(jié)構(gòu)目標(biāo)化合物，經(jīng)細(xì)胞水平和酶水平活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)多個(gè)抗HIV-1(RT)活性達(dá)到納摩爾級(jí)活性的抑制劑，部分抑制劑對(duì)HIV-1 K103N/Y181C雙突變株也有一定抑制作用。化合物ⅠC-Ⅵ2對(duì)HIV-1 RT的抑制活性超過最新先導(dǎo)藥物RPV，且母環(huán)結(jié)構(gòu)新穎，具有重要開發(fā)價(jià)值。另有化合物ⅠA-Ⅰ6、ⅠA-Ⅱ3和ⅠD-Ⅰ4水溶性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過ETR，有望進(jìn)一步改善生物利用度，且活性與先導(dǎo)相同或處于同