AffimeR-抗體雜合化學(xué)發(fā)光免疫分析法的建立及其在血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC3)是一個(gè)有價(jià)值的肝細(xì)胞癌(HCC)診斷標(biāo)志物，然而到目前為止，尚未有可靠的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒應(yīng)用于臨床。
　　目的:
　　以GPC3非抗體結(jié)合蛋白(non-antibody binding proteins，nABPs)的一員Affimer和GPC3單克隆抗體（monoclonal antibody，mcAb，以簡(jiǎn)稱Ab）為免疫原料，建立化學(xué)發(fā)光免疫分析法，評(píng)價(jià)其分析性能及

2、其在臨床診斷中的價(jià)值，探討Affimer作為免疫分析試劑原料的可行性。
　　方法:
　　1.對(duì)團(tuán)隊(duì)篩選制備的Affimers和Abs進(jìn)行純化及鑒定，通過(guò)棋盤滴定法篩選獲取信噪比最佳的配對(duì)包被及標(biāo)記物質(zhì)。
　　2.以Affimer-Ab雙夾心為反應(yīng)模式建立GPC3化學(xué)發(fā)光免疫分析法，優(yōu)化磁微球包被濃度、生物素與抗體的連接比例和吖啶酯標(biāo)記鏈霉親和素比例等反應(yīng)參數(shù)后，小試生產(chǎn)Affimer-Ab雜合GPC3化學(xué)發(fā)光免疫分析試

3、劑。
　　3.對(duì)小試試劑進(jìn)行最低檢測(cè)限、特異性、回收率等分析性能的評(píng)估，同期與GPC3雙抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行分析性能的比對(duì)。
　　4.用小試試劑盒及3個(gè)雙抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)臨床血樣（HCC患者、肝硬化患者、肝內(nèi)膽管癌患者、慢性乙肝患者、慢性丙肝患者、健康體檢者患者、胃腸癌患者和肺癌患者）中GPC3水平。免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測(cè)HCC組織標(biāo)本。曲線下面積和相關(guān)性分析等用于分析檢驗(yàn)試劑盒的檢測(cè)效能。
　　結(jié)果:
　

4、　1.純化后所有原料均符合實(shí)驗(yàn)要求，確定Affimer-GPC3-22和Ab-7D11分別為本方法的包被和標(biāo)記物質(zhì)。
　　2.確定了本方法最佳反應(yīng)條件:2步法的儀器運(yùn)行模式;Affimer-GPC3-22包被磁微球質(zhì)量比為1∶80，生物素與抗體連接的質(zhì)量比為1∶10，吖啶酯與鏈霉親和素標(biāo)記的質(zhì)量比為1∶50;磁微球工作稀釋緩沖液pH為7.8;參考標(biāo)準(zhǔn)品加樣體織為60μL;包被磁微球、生物素化抗體和吖啶酯標(biāo)記鏈霉親和素最佳工作稀釋度

5、分別為800μg/mL、1∶250和1∶500;繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到回歸方程為y=3.95+1.03x(R=0.9999)。
　　3.分析性能評(píng)價(jià)結(jié)果:本試劑最低檢測(cè)限為0.03ng/mL;特異性交叉反應(yīng)率為0-0.002％;在線性范圍0.03-600ng/mL時(shí)，R=0.9999;回收率在91.80％-104.53％之間;批內(nèi)、批間精密度CV在6.06-8.98％之間;檢測(cè)樣本時(shí)不受膽紅素、溶血、乳糜微粒的干擾;效期穩(wěn)定性不少

6、于12個(gè)月，開(kāi)瓶穩(wěn)定性為14天。與商業(yè)化GPC3試劑盒比對(duì)，本方法靈敏度適中、特異性好、線性范圍寬。
　　4.本試劑正常參考值范圍為0-1.1ng/mL;HCC組GPC3血清水平明顯高于其他組（＞16倍，P值均小于0.001）;術(shù)前GPC3表達(dá)水平明顯高于術(shù)后第一天和第七天，且呈逐步下降的趨勢(shì);四個(gè)試劑盒相關(guān)性均較差（r在-0.286至0.478之間）;與IHC檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，本方法顯示良好的特異性和一致性(Kappa=0.655)