電化學發(fā)光免疫分析法課件

1、化學發(fā)光免疫分析法,Chemiluminescence Immunoassay,免疫分析,基于抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種手段；免疫標記技術是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質(zhì)標記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。,免疫學檢測歷史演進,放射免疫檢測（興起于20世紀70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級以上醫(yī)院）；酶聯(lián)免疫檢測（興起于20世紀80年代，各臨床機構普遍

2、使用）；以化學發(fā)光為代表的光生物學標記及免疫檢測技術（20世紀90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長期）三個階段。,,,生活中常見的化學發(fā)光現(xiàn)象,發(fā)光分類,光照發(fā)光（熒光）:發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài)，當回復至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。生物發(fā)光：反應底物在熒光素酶的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出。化學發(fā)光,化學發(fā)光Chemiluminescence (CL),化學

3、發(fā)光是指在某些特殊的化學反應中，反應的中間體或產(chǎn)物由于吸收了反應釋放的化學能而處于電子激發(fā)態(tài)，當其回到基態(tài)時伴隨產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象。,化學發(fā)光原理,所謂化學發(fā)光 (CL) , 就是化學反應的能量把體系中共存的某種分子從基態(tài)激發(fā)到激發(fā)態(tài)從而產(chǎn)生發(fā)光的現(xiàn)象。,化學發(fā)光的分類,直接化學發(fā)光 A + B ? C* + DC* ? C + h?例

4、: NO + O3 ? NO2* + O2 NO2* ? NO2 + h?,化學發(fā)光的分類,間接化學反應發(fā)光 A + B —> C* + D C* + E —> E* + C E* —> E + h?,,化學發(fā)光免疫技術中常用的化學發(fā)光劑或發(fā)光底物,酶促反應的發(fā)光底物 直接化學發(fā)光劑 電化學發(fā)光劑,1．酶促反應的發(fā)光底物,酶促反應的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物，目

5、前化學發(fā)光酶免疫技術中常用的酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP），相應發(fā)光底物為：,(1) HRP的發(fā)光底物,常用的底物為魯米諾或其衍生物和對-羥基苯乙酸。①魯米諾或其衍生物 魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行，通常以0.1mol/L pH8.6 Tris緩沖液作底物液。,H2O2 /OH — HRP,,+N2 + H2O +光,,,② HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚體（熒光 物質(zhì)），在350n

6、m激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長 的熒光，可用熒光光度計測量。,H2O2HRP,,+熒 光,氧化二聚體,,（2）ALP的發(fā)光底物,常用的底物為3-（2-螺旋金剛烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基傘形酮磷酸鹽（4-MUP，熒光底物）。,①AMPPD,AMPPD在堿性條件下，被ALP酶解生成相當穩(wěn)定的AMP-D陰離子，其有2-30min的分解半衰期，發(fā)出波長為470nm的持

7、續(xù)性光，在15min時其強度達到高峰，15~ 60min內(nèi)光強度保持相對穩(wěn)定。,光,AP /OH — HPO4 2—,,,,②4-MUP,4-MUP在ALP催化下生成4-甲基傘形酮，在360nm激發(fā)光的作用下，發(fā)出448nm的熒光，用熒光光度計進行測量。,,熒光,AP,,H3PO4 +,,360nm激發(fā)光,CAP TODAY調(diào)查結果-Mar. 2003,全自動免疫分析系統(tǒng)全球市場占有率,ChemiflexTM – 效

8、應,Sulfupropyl Derivative穩(wěn)定性組分極其穩(wěn)定,10月效期, 30 天上機,最少30 天校正曲線,Nitrogen Bond (吖啶Sulfonamide Group) 穩(wěn)定性組分產(chǎn)生巨大的光 (50% more)優(yōu)異的靈敏度和線性范圍(TSH 0.008 uIU/mL),,,,,,,專利的化學發(fā)光標記物,提升檢測功能靈敏度增加檢測線性范圍降低定標頻率延長試劑效期,專利的穩(wěn)定(sulfo

9、propyl)基團,專利的發(fā)光(sulfonamide)基團,ARCHITECT® 使用pre-trigger/trigger雙重反應來提升和產(chǎn)生光信號,直接夾心法分析模式 磁微粒子上包被的抗體與分析物及專利的吖啶酯標記抗體結合,ARCHITECT HBsAg Assay Design,經(jīng)過最后一步?jīng)_洗,磁微粒子上捕捉有免疫復合物,Pre-Trigger 被加入Pre-Trigger使專利的吖啶酯標記物從固相載體上釋放到溶

10、液中,磁塊吸附 磁微粒子被磁塊吸附在反應杯的壁上,從而防止磁粒子對光信號檢測的干擾,Trigger 被加入提供一個堿性環(huán)境產(chǎn)生光信號,吖啶酯標記物被釋放產(chǎn)生光信號,產(chǎn)生的信號以Relative Light Unit (RLU)方式表達.,ARCHITECT® 使用pre-trigger/trigger雙重反應來提升和產(chǎn)生光信號,競爭法分析模式 分析物及專利的吖啶酯標記物與磁微粒子上包被的抗體競爭結合,Chemiflex

11、 …靈活的處理步驟,靈活的步驟,獨有的化學發(fā)光,一步法加樣本+結合物加固相單步?jīng)_洗讀數(shù),兩步法加樣本+固相一步?jīng)_洗加結合物兩步?jīng)_洗讀數(shù),預處理加樣本, 預處理轉(zhuǎn)移預處理液加固相一步?jīng)_洗加結合物兩步?jīng)_洗讀數(shù),分析設計的靈活性分析設計并沒有局限于一步法新項目開展時間大大減少超級分析表現(xiàn)基于不同的測試, 應用不同的方法設計,Chemiflex,,,,,,,,,ARCHITECT分析項目,肝炎乙肝表面

12、抗原確證乙肝表面抗原(定量)乙肝表面抗體(定量)乙肝核心抗體乙肝e抗原乙肝e抗體丙肝抗體(第三代)甲肝總抗體*甲肝IgM抗體*艾滋抗體*HTLV1/2抗體*腫瘤標志物甲胎蛋白癌胚抗原糖類抗原125*糖類抗原153*糖類抗原199游離前列腺特異性抗原總前列腺特異性抗原Pepsinogen I(胃癌)B2-微球蛋白*,生殖/內(nèi)分泌總B人絨毛膜促性腺激素促黃體生成素促卵泡生成素雌二醇孕酮睪

13、酮催乳素雌三醇*藥物濃度監(jiān)測地高辛*茶堿*卡馬西平*苯巴比妥*丙戊酸*洋地黃*慶大霉素*萬古霉素*苯妥英鈉**待開發(fā)項目,甲狀腺功能三碘甲狀腺原氨酸甲狀腺素游離三碘甲狀腺原氨酸游離甲狀腺素超敏促甲狀腺素先天性疾病風疹病毒IgG*風疹病毒IgM*弓型蟲IgG*弓型蟲IgM*巨細胞病毒IgG*巨細胞病毒IgM*梅毒*代謝鐵蛋白B12葉酸糖化血紅蛋白心肌鈣蛋白-I*肌酸

14、激酶*,RSH-靈活的軌道系統(tǒng),獨特的三維立體設計提供連續(xù)和靈活運行模式多色的閃爍燈提示操作員軌道狀況,及時進行必要處理急診和重檢樣品優(yōu)于常規(guī)樣品的操作,最大限度減少緊急樣品檢測時間,急診/優(yōu)先樣品架位,單個5個樣本位的ARCHITECT樣本架7個樣本架共有35個樣本位插入樣本架后系統(tǒng)自動選擇優(yōu)先測試指示燈直觀顯示架位情況,常規(guī)樣品盤位,每個樣本盤可放置5個ARCHITECT樣本架共25個樣本i2000SR樣本盤位數(shù)量為4個

15、樣本架運行順序為從左至右、先進先出指示燈直觀顯示盤位情況,,RSH--提高工作流程的效率,實驗室樣品的快速靈活分樣是通過RSH和強大的Architect軟件實現(xiàn)自動稀釋自動重檢自動反射樣品架運輸速度達0.9m/s加速度兩個樣本間的吸樣間隔<2秒急診/優(yōu)先樣品<3分鐘完成分樣為將來生化和免疫的整合提供必要的條件,試劑通道,25個試劑位置自動旋轉(zhuǎn),混勻試劑試劑包裝100和500人份試劑冰箱,消耗品,反應杯

16、容器一次最多可放置1200個反應杯(RV)可連續(xù)放置,RV杯的放置,智能化探針,不銹鋼樣品/試劑探針有防撞功能設計智能探針清洗模式(緩沖液,清潔劑和不同清洗模式)探針自動定位校正凝塊,氣泡和液面感應<25ul的死體積量,智能沖洗設計,沖洗模塊(Wash manifold)3針沖洗,干凈徹底相互獨立沖洗吸液監(jiān)測(WAM)在沖洗中進行溫度感應監(jiān)測確保液體吸/放的正確,預激發(fā)液和激發(fā)液,抽送式設計,方便安放大容

17、量上機試劑預激發(fā)液:3000測試,15小時離機時間激發(fā)液:9000測試,45小時離機時間,預激發(fā)液,激發(fā)液,大瓶清洗液,上機緩沖液25升(1000T)濃縮緩沖液(1:10)系統(tǒng)自動抽入,,,濃縮洗液,,固體廢物的排放,反應杯干燥排放可一次排放1000測試15分鐘的連續(xù)排放時間,,Waste chute,確保廢物更換,廢液的排放,外接式液體排放可下排或接泵上排,Architect 操作軟件,“形象化”的用戶軟件圖標操作

18、容易操作遠程診斷機上操作手冊 在線幫助自動提醒和更新的保養(yǎng)手冊,Architect 主菜單,Architect 保養(yǎng)手冊,Architect i2000SR(免疫模塊)可整合的儀器,Chemiflex TM專利技術靈活步驟(一步,二步和預處理)化學發(fā)光(高靈敏度,寬線性和高穩(wěn)定性)保證200 測試/小時靈活的上樣方式135 個一次最大上樣量35 個急診 /優(yōu)先樣品位100 個常規(guī)樣品位原試管,血清管或樣品杯急診

19、分析 18分鐘自動稀釋,重檢,轉(zhuǎn)測和預處理 25 個冷藏試劑位置 500 & 100 測試/盒 >30 天上機穩(wěn)定期5 小時離機時間圖標式易操作軟件 可與 c8000整合成 ci8200,ARCHITECT ci8200: 重要特點摘要,免疫生化檢測的整合速度最高 200測試/小時（免疫）最高1200測試/小時（生化）運行能力367條碼識別樣品管冷藏試劑倉，免疫25個，生化68個 工作流程效率的

20、提升免疫，急診18 分鐘自動重檢/反射能力無須樣品分開降低技術人員的勞動,壓力凝塊檢測攜帶率 <0.1ppm,2．直接化學發(fā)光劑,這類發(fā)光劑不需酶的催化作用，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光，如吖啶酯（acridinium, AE）在含過氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)光。,3.電化學發(fā)光劑,是指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出光的物質(zhì)?；瘜W發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+（圖19-1）和電子供體三丙胺（TPA）在陽性

21、電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應。二價的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三價，成為強氧化劑，TPA失去電子后被氧化成陽離子自由基TPA+，它很不穩(wěn)定，可自發(fā)地失去一個質(zhì)子（H+），形成自由基TPA.，成為一種很強的還原劑，可將一個高能量的電子遞給三價的[Ru(bpy)3]3+使其形成激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+.。激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，很快發(fā)射出一個波長為620nm的光子，回復到基態(tài)的三聯(lián)吡啶釕。這一過程可在電極表面周而

22、復始地進行，產(chǎn)生許多光子，使光信號增強,化學發(fā)光免疫分析chemiluminescence immunoassay（ CLIA）,CLIA是將化學發(fā)光分析和免疫反應相結合而建立的一種新的免疫分析技術。這種方法兼有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應的高度特異性。,免疫發(fā)光技術要點,包括抗原抗體反應標記物游離部分和結合部分分離發(fā)光反應及檢測等三部分。,（一）抗原抗體反應,抗原抗體反應模式主要有以下三類。1．雙抗體夾心法　2．雙抗原

23、夾心法　3．固相抗原競爭法,1．雙抗體夾心法,用固相抗體和酶標抗體與待測標本中相應抗原反應，生成固相抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)B/F分離，加入底物經(jīng)酶促反應后發(fā)光，其發(fā)光量與待測標本中抗原含量呈正比。,2．雙抗原夾心法,該法常用于抗體的檢測，用固相抗原和酶標記抗原與待測標本中相應抗體反應，生成固相抗原-待測抗體-酶標抗原復合物，經(jīng)B/F分離，在免疫復合物中加入底物進行酶促發(fā)光，其發(fā)光量與待測標本中抗體含量呈正比。,3．固相抗原競爭

24、法,該法常用于多肽類小分子抗原的測定，用已知固相抗原和待測標本的相應抗原與一定量的酶標記抗體發(fā)生競爭性結合反應，反應平衡后經(jīng)B/F分離，固相抗原與酶標抗體形成復合物被留下來，通過加入底物進行酶促發(fā)光反應，其發(fā)光量與待測標本中抗原含量呈反比。,（二）游離和結合部分分離,是將游離酶標記物和酶標記物免疫復合物進行分離過程，常用分離技術有：1．磁顆粒分離法2．微粒子捕獲法3．包被珠分離法,1．磁顆粒分離法,用抗原或抗體包被的磁顆粒與標本中

25、相應抗原或抗體和酶標的抗體或抗原通過一定模式的免疫學反應后,最終通過磁場將結合酶標記物免疫復合物和游離酶標記物進行分離的技術。,2．微粒子捕獲法,與磁顆粒分離法所不同是所用顆粒是無磁性的微粒子作為抗體或抗原的包被載體, 然后用纖維膜柱子進行酶標記物的結合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離。,3．包被珠分離法,將用聚苯乙稀等實驗材料制成小珠, 在小珠上包被抗原或抗體,經(jīng)抗原抗體反應后,將結合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標記物進行分離。,（三）化學發(fā)光和檢測,以熒

26、光酶免疫分析為例，加入底物4-MUP，酶標抗體上ALP將4-MUP分解，脫磷酸根基團后形成4-甲基傘形酮（4-MU），它在360nm激發(fā)光的照射下，發(fā)出448nm的熒光，經(jīng)熒光讀數(shù)儀記錄，放大，最后根據(jù)標準曲線由電腦計算出所測物質(zhì)的含量。,電化學發(fā)光（ECL),電致化學發(fā)光 (ECL) 是通過在電極上施加一定波形的電壓或電流信號進行電解反應的產(chǎn)物之間或與體系中共存組分反應產(chǎn)生化學發(fā)光的現(xiàn)象。ECL與CL的差異在于ECL是電啟動發(fā)光反應

27、，而CL是通過化合物混合啟動發(fā)光反應。因此ECL反應易精確控制，具有靈活性。,電化學發(fā)光劑,定義：指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出光的物質(zhì)。特點反應在電極進行化學發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕電子供體為：三丙胺（TPA）,三聯(lián)毗啶釕分子結構圖,三聯(lián)吡啶釕（ [Ru(bpy)3]2+ ）特點,ECL分析中采用[Ru(bpy)3]2+作為標記物，其活化衍生物是[Ru(bpy)3]2+＋N羥基琥珀酸胺酯（NHS） ，該衍生物具有水溶性，且高

28、度穩(wěn)定，保證電化學發(fā)光反應的高效和穩(wěn)定，而且避免了本底噪聲的干擾。,三聯(lián)吡啶釕（ [Ru(bpy)3]2+ ）特點,[Ru(bpy)3]2+衍生物與免疫球蛋白結合的分子比超過20仍不會影響抗體的可溶性和免疫活性；[Ru(bpy)3]2+分子量小，空間位阻小 ，即便小分子的核酸也能標記，使檢測的菜單大大豐富，更重要的是為其檢測菜單的開發(fā)前景提供了廣闊空間。,電化學發(fā)光原理圖,基態(tài),激發(fā)態(tài),不穩(wěn)定,電化學發(fā)光免疫分析(Electro-C

29、hemiluminescence Immunoassay, ECLI),ECLI是繼EIA、RIA、FIA、時間分辨熒光免疫技術（TRFIA）之后的新一代標記免疫測定技術； ECLI是電化學發(fā)光(ECL)和免疫測定相結合的產(chǎn)物；ECLI是目前最先進的標記免疫測定技術之一。,ECLI原理,在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應，用電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+標記Ab，通過Ag-Ab反應和磁珠分離技術，根據(jù)三聯(lián)吡啶

30、釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的Ag或Ab進行定量/定性。,,ECLIA檢測流程圖一（雙抗體夾心的形成）,ECLIA檢測流程圖二 （生物素與親和素結合）,,ECLIA體系結構圖,,,,,,ECLIA檢測流程圖三 （磁珠吸引吸附于電極表面）,ECLIA檢測流程圖四 （電極充電啟動電化學反應）,ECLIA檢測流程圖五 （撤消磁場沖洗磁珠）,方法評價,采用的固相載體是帶有磁性的直徑約

31、2.8 μm的聚苯乙烯微粒。其特點是反應面積比板式擴大20－30倍，吸附效率高；在液體中形成均勻的懸液，參與反應時類似液相，反應速度大大加快；,方法評價,“鏈霉親和素-生物素”是是具有很強的非共價相互作用的一對化合物，具有牢固而特異的結合，應用此放大系統(tǒng)，使檢測的靈敏度大大提高；,方法評價,利用氧化鐵的磁性，使用電磁場分離結合態(tài)和游離態(tài)，方便迅速，實現(xiàn)了精確的全自動化；標記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光時間更長、強度更高、易于測定。,ELIA