類胰島素生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)的作用機制及功能進化研究.pdf

1、IGF結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)是一種細胞外分泌蛋白,它能結(jié)合IGF并調(diào)控IGF信號。IGFBP-3在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中還表現(xiàn)出配體非依賴的功能。除了IGF結(jié)合域(IBD),哺乳動物IGFBP-3還有一個核定位信號(NLS)和轉(zhuǎn)錄激活域(TA)。但是,IGFBP-3的這些結(jié)構(gòu)域的體內(nèi)功能尚不明確。本研究顯示這些結(jié)構(gòu)域在斑馬魚IGFBP-3中也是保守的,并構(gòu)建了數(shù)個IGFBP-3突變體來研究這些結(jié)構(gòu)域的功能。IBD突變體不能結(jié)合IGF

2、-1但核定位正常;NLS突變體核定位能力大大削減,但能與IGF正常結(jié)合;IBD和NLS雙突變體則核定位和結(jié)合IGF都受影響;另外,還確定了斑馬魚IGFBP-3的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(TA)的重要氨基酸并構(gòu)建了TA突變體。當在斑馬魚中過表達IGFBP-3的各種突變體時,野生型IGFBP-3,及NLS和TA突變體都能明顯地使斑馬魚胚胎背部化;IBD和IBD+NLS突變體的活性略為下降。這些實驗表明IGFBP-3可以通過IGF依賴/非依賴性的方式發(fā)

3、揮作用,而且IGF非依賴性作用與其核定位和轉(zhuǎn)錄激活功能無關(guān)。由于IGFBP-3引起的表型與bmp2b的突變體swirl相似,為了研究IGFBP-3是否可以拮抗BMP信號通路,將斑馬魚Bmp2b與IGFBP-3和IBD突變體進行了共表達。在體內(nèi)IGFBP-3和IBD突變體都減弱了Bmp2b引起的腹部化,并能減弱由Bmp2b誘導的下游基因tp63的表達。在斑馬魚中過表達IGFBP-3和IBD,可以上調(diào)chordin的表達。共過表達IGFBP

4、-3和Chordin可以增強斑馬魚胚胎的背部化。體外試驗證實,IGFBP-3可以結(jié)合BMP-2,抑制由BMP-2誘導的Smadl/5/8的磷酸化。而且,向C3H/10T1/2細胞中添加人的IGFBP-3與BMP-2可以抑制由BMP-2誘導的成骨細胞分化。這些結(jié)果表明IGFBP-3能結(jié)合BMP-2并且抑制BMP信號的作用。
　　 脊椎動物在進化過程中經(jīng)歷了2次全基因組倍增事件(2R假說),七鰓鰻在進化地位上是處于2次基因組倍增之間

5、的、現(xiàn)存的最早的脊椎動物之一。本論文從古老的無頜類七鰓鰻(Petromyzon marinus)中克隆得到了一個Igfbp-3基因,它可編碼6種ORF。其中IGFBP-3 ORF1含有IBD、NLS和TA,它能以與IGF結(jié)合,定位于細胞并且其N-端結(jié)構(gòu)域具有轉(zhuǎn)錄激活活性。顯微注射IGFBP-3ORF1的mRNA可使斑馬魚的胚胎背部化,這種背部化作用部分是IGF非依賴性的,但不依賴于核定位信號和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。IGFBP-3 ORF1還能

6、以IGF非依賴的方式抑制肚flk1:EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚的血管生成。將IGFBP-3 ORF1以及它的IGF結(jié)合突變體的mRNA分別與Bmp2b的mRNA顯微共注射發(fā)現(xiàn),IGFBP-3ORFl能以IGF非依賴性地拮抗:BMP信號通路,而且IGFBP-3 ORF1能以IGF非依賴的方式直接抑制BMP信號通路下游基因tp63 mRNA的表達。但是,七鰓鰻IGFBP-3的其它ORF并沒有上述功能。進一步序列分析發(fā)現(xiàn),從已克隆的和預(yù)測的多種物種