胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白6的功能研究.pdf

1、由于IGF家族重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用，對(duì)IGFBP家族活性的研究成為近年來該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)了這一家族蛋白越來越多的生物活性。其中，IGFBP-6是IGFBP家族中發(fā)現(xiàn)最晚、被研究的較少的蛋白，但I(xiàn)GFBP-6是IGF-Ⅱ的高親和力結(jié)合蛋白，對(duì)IGF-Ⅱ活性具有重要的調(diào)節(jié)作用。IGFBP-6所具有的抑制IGF-Ⅱ促腫瘤生長(zhǎng)活性的作用已經(jīng)在很多腫瘤細(xì)胞系中得到了證實(shí)。IGFBP-6在體內(nèi)廣泛的分布及其與IGF-Ⅱ的特殊關(guān)系表明對(duì)其活性的

2、研究具有重要的意義。本論文的研究工作從以下方面對(duì)IGFBP-6的功能進(jìn)行了研究。 首先在酵母表達(dá)體系中分泌表達(dá)了重組人IGFBP-6，分離純化得到了純品，檢測(cè)了活性，并對(duì)IGFBP-6在真核細(xì)胞中的分布做了初步的研究。 1.成功構(gòu)建了三拷貝的酵母表達(dá)載體pA0815-3IGFBP-6，轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，篩選到了高表達(dá)產(chǎn)量的菌株，優(yōu)化了表達(dá)條件。 2.成功分離純化了IGFBP-6表達(dá)上清，得到了純度大于90％的I

3、GFBP-6。 3.檢測(cè)了IGFBP-6抑制IGF-Ⅱ促腫瘤細(xì)胞A549增殖的活性。 4.利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)和EGFP融合蛋白轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，首次觀察到了IGFBP-6可以進(jìn)入細(xì)胞，以及在細(xì)胞核中的分布。提示IGFBP-6具有在細(xì)胞內(nèi)的不依賴IGF-Ⅱ的生物活性。 其次，利用酵母雙雜交系統(tǒng)3篩選了小鼠腦cDNA文庫(kù)，得到了兩個(gè)能夠與IGFBP-6相互作用的蛋白質(zhì)。經(jīng)過生物信息學(xué)的分析，確定了這兩個(gè)蛋白質(zhì)分別是鋅指蛋白KI

4、AA0530和泛素融合蛋白UBA52。 另外，研究了IGFBP-6在IGF-Ⅱ翻譯加工及分泌表達(dá)過程中可能的作用機(jī)制。 1.構(gòu)建了IGFBP-6與IGF-Ⅱ共表達(dá)的酵母表達(dá)載體pA0815-2(IGF-Ⅱ-IGFBP-6)，轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，篩選到了共表達(dá)IGF-Ⅱ和IGFBP-6的陽(yáng)性菌株，進(jìn)行了搖瓶規(guī)模表達(dá)條件的優(yōu)化。 2.檢測(cè)了共表達(dá)產(chǎn)物中IGF-Ⅱ的二硫鍵的折疊情況，得到了二硫鍵正確折疊的IGF-Ⅱ，解

5、決了IGF-Ⅱ單獨(dú)表達(dá)時(shí)二硫鍵不能正確折疊的問題。 3.成功純化出了結(jié)合狀態(tài)的IGF-Ⅱ和IGFBP-6復(fù)合物，為進(jìn)一步研究IGF-Ⅱ與IGFBP-6的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。 通過上述工作，首次報(bào)道了在畢赤酵母中分泌表達(dá)IGFBP-6，觀察到了IGFBP-6可以進(jìn)入細(xì)胞，并且在細(xì)胞核中有所分布。初步篩選到了能夠與IGFBP-6相互作用的蛋白，為進(jìn)一步深入研究IGFBP-6在細(xì)胞內(nèi)的生物活性奠定了基礎(chǔ)。并提供了IGFBP-