桑蠶絲蛋白的微纖化和物理凝膠化研究——以富含β-折疊的蛋白質(zhì)材料結(jié)構(gòu)調(diào)控的啟示.pdf

1、經(jīng)過(guò)億萬(wàn)年對(duì)自然的適應(yīng)與進(jìn)化,動(dòng)物(主要指蜘蛛和蠶)制造出富含β-折疊結(jié)構(gòu)的“完美”纖維——?jiǎng)游锝z。在半個(gè)多世紀(jì)的大量研究中,人們對(duì)動(dòng)物絲從一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)到聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的完整等級(jí)結(jié)構(gòu)已有初步認(rèn)識(shí),并己將其應(yīng)用于制備各種宏觀尺度的材料上。淀粉樣微纖是另一類富含β-折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)纖維,其雖然最初發(fā)現(xiàn)于病變組織中,但是隨著越來(lái)越多非致病性蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)能夠形成淀粉樣微纖,人們極大地拓寬了將基于β-折疊蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性材料發(fā)展成一類重要天然

2、生物材料的潛在原料來(lái)源。然而,如何將淀粉樣微纖在納米尺度上的等級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成宏觀材料仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。
　　本論文以桑蠶絲蛋白為研究對(duì)象,對(duì)其物理凝膠化和微纖化進(jìn)行了細(xì)致研究,探索了多種調(diào)控β-折疊(高等級(jí))結(jié)構(gòu)形成的手段,并初步探討了桑蠶在吐絲結(jié)繭前防止腺體內(nèi)絲蛋白過(guò)早形成β-折疊結(jié)構(gòu)的主動(dòng)調(diào)控機(jī)制,希冀對(duì)富含β-折疊蛋白質(zhì)材料的結(jié)構(gòu)調(diào)控有所啟示。
　　我們首先通過(guò)改變制備條件,得到了兩種β-折疊結(jié)構(gòu)不同的絲蛋白(SF)微

3、纖:1)在靜態(tài)乙醇/水溶液中,絲蛋白自組裝成“cross-β”結(jié)構(gòu)(分子鏈方向與纖維軸向垂直)的納米微纖;2)在剪切力存在的水溶液中,絲蛋白自組裝成“paurallel-β”結(jié)構(gòu)(分子鏈方向與纖維軸向平行)的微纖。通過(guò)進(jìn)一步比較兩種微纖中β-折疊結(jié)構(gòu)的差別表明,對(duì)于乙醇/水溶液中形成的SF納米微纖,在其“連續(xù)”的cross-β-折疊結(jié)構(gòu)中,沿氫鍵方向排列的分子鏈數(shù)目應(yīng)該至少在15根以上;而剪切誘導(dǎo)下形成的SF微纖,其β-折疊結(jié)構(gòu)中,沿氫

4、鍵方向排列的分子鏈數(shù)目可能大多分布在4～10根范圍內(nèi),且被未形成β-折疊結(jié)構(gòu)或所形成β-折疊結(jié)構(gòu)并不完善的分子鏈段隔開(kāi)。我們還通過(guò)對(duì)絲蛋白氨基酸序列(由5263個(gè)氨基酸殘基組成)的分析,提出了絲蛋白“cross-β”納米微纖的結(jié)構(gòu)模型。本研究中所提出的利用機(jī)械外力(如剪切力)來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)的方法,為設(shè)計(jì)新型的以β-折疊結(jié)構(gòu)為主的蛋白質(zhì)(多肽)纖維材料提供了新的思路。
　　接著,我們研究了乙醇誘導(dǎo)所形成絲蛋白凝膠的等級(jí)結(jié)構(gòu)及其

5、生成動(dòng)力學(xué)。結(jié)果表明,絲蛋白醇凝膠是一類由納米微纖和絮狀物分別在納米和微米尺度上形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜二元分形體。通過(guò)動(dòng)力學(xué)分析得到微纖簇的分形維數(shù)在2.4～2.8之間,并隨絲蛋白起始濃度的增大而增大。通過(guò)標(biāo)度分析得到的“絮狀網(wǎng)絡(luò)”的分形維數(shù)為2.2。絲蛋白的微纖化遵循成核-增長(zhǎng)機(jī)制,微纖在生長(zhǎng)過(guò)程中不斷的發(fā)生分叉或纏繞,形成微纖簇,同時(shí),由不同的“核”生長(zhǎng)形成的微纖簇,最終相互交疊聚集,導(dǎo)致絮狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。研究結(jié)果還表明,微纖化和凝膠

6、化的動(dòng)力學(xué)過(guò)程同時(shí)受制于乙醇和SF的濃度。提高乙醇的濃度,可以加速微纖化的成核過(guò)程,但是不同乙醇濃度下形成的微纖簇結(jié)構(gòu)相似。SF的濃度不但影響凝膠動(dòng)力學(xué),還影響到最終形成的凝膠的機(jī)械性能,如凝膠的彈性模量和在大應(yīng)變下的應(yīng)變硬化程度。
　　我們還發(fā)展了一種新型的SF-HPC(羥丙基纖維素)共混水凝膠,其可在37℃的溫和條件下形成,且具有觸變性而成為一種可注射的凝膠。通過(guò)動(dòng)態(tài)流變學(xué)、激光共聚焦掃描顯微鏡、拉曼光譜和核磁共振等技術(shù)對(duì)凝膠

7、的表征,我們提出SF-HPC共混水凝膠如下可能的形成機(jī)制:1)從室溫升至37℃時(shí),具有LCST的HPC分子鏈間的疏水相互作用增強(qiáng),誘導(dǎo)共混體系發(fā)生經(jīng)由成核-生長(zhǎng)機(jī)制進(jìn)行的相分離;相分離導(dǎo)致SF富集相的產(chǎn)生,促使SF發(fā)生由無(wú)規(guī)線團(tuán)向β-折疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變;2)相結(jié)構(gòu)發(fā)生粗大化,與此同時(shí),由SF所形成的β-折疊結(jié)構(gòu)逐漸增加,直到貫穿體系的凝膠網(wǎng)絡(luò)形成;3)SF分子中的β-折疊結(jié)構(gòu)進(jìn)一步增加和完善,提供更多的交聯(lián)點(diǎn),使凝膠網(wǎng)絡(luò)得以發(fā)展,而處于分散

8、相中的分子鏈運(yùn)動(dòng)受限,導(dǎo)致相結(jié)構(gòu)的粗大化無(wú)法進(jìn)一步進(jìn)行,使已形成的相結(jié)構(gòu)最終被“凍結(jié)”下來(lái)。通過(guò)改變共混體系的組成,能夠?qū)F-HPC共混水凝膠的相分離和凝膠化動(dòng)力學(xué)進(jìn)行控制,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)凝膠微觀形貌、機(jī)械強(qiáng)度和觸變性的調(diào)控。增加共混體系中SF的含量可以縮短凝膠時(shí)間,并改變凝膠點(diǎn)附近的凝膠性質(zhì)。大振幅振蕩剪切(LAOS)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,混合比為7/3(SF/HPC)的水凝膠,在大剪切下可能經(jīng)歷了“β-折疊結(jié)構(gòu)富集域間的彈性形變一富集域間弱

9、交聯(lián)點(diǎn)被破壞-富集域的滑移-弱交聯(lián)點(diǎn)重建”的過(guò)程,使得此組成下的水凝膠具有顯著的觸變性。我們利用該混合比下的SF-HPC共混水凝膠成功實(shí)施了對(duì)細(xì)胞(如L929成纖維細(xì)胞)的包埋,并證明水凝膠在注射過(guò)程中對(duì)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用,同時(shí),細(xì)胞在經(jīng)注射凝膠中的分布仍較為均勻。由于構(gòu)成凝膠的兩種組份均具有良好的生物相容性和生物可降解性,致使此類可注射水凝膠在藥物和細(xì)胞輸運(yùn)載體等生物醫(yī)用領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
　　最后,我們研究了“凝膠狀”

10、的天然桑蠶紡絲原液的流變性能,發(fā)現(xiàn)液晶態(tài)的紡絲原液在流動(dòng)類型上屬于翻滾型(tumbling),因此在中等剪切速率下呈現(xiàn)負(fù)的第一法向應(yīng)力差,并在起始流中表現(xiàn)出粘度(應(yīng)力)和第一法向應(yīng)力周期性振蕩的流變行為。通過(guò)對(duì)振蕩周期的分析,我們計(jì)算出決定向列型液晶流動(dòng)類型的參數(shù)λ,其絕對(duì)值為0.996,表明絲蛋白分子在形成液晶時(shí)形狀上具有很大的各向異性。結(jié)合不同流變學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,并借鑒超分子液晶基元模型,我們提出了天然紡絲原液受到剪切作用時(shí)從靜止到流

11、動(dòng)過(guò)程的三種狀態(tài):1)靜態(tài)時(shí),絲蛋白分子間可能通過(guò)超分子相互作用形成“瞬態(tài)網(wǎng)絡(luò)”(其模量在1.2×104～2.0×104pa之間,其松弛時(shí)間在0.5～3s之間),此時(shí)液晶基元包含于網(wǎng)絡(luò)中;2)當(dāng)紡絲原液受到剪切力作用時(shí),絲蛋白分子之間的相互作用部分被破壞,高彈性的“瞬態(tài)網(wǎng)絡(luò)”開(kāi)始變軟;3)當(dāng)剪切力進(jìn)一步增加時(shí),“瞬態(tài)網(wǎng)絡(luò)”的結(jié)構(gòu)被完全破壞,原來(lái)構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)的絲蛋白超分子液晶基元開(kāi)始沿剪切方向流動(dòng),并進(jìn)行翻滾。我們推測(cè)絲蛋白液晶基元在中等剪切