脈沖直流電場誘導表皮細胞電趨性的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　自19世紀發(fā)現人體生理電場以來，從細胞實驗到在體實驗，人們對電場誘導細胞遷移、促進創(chuàng)面愈合的作用進行了大量研究。研究發(fā)現，正常皮膚表皮或上皮組織細胞間能夠維持定向的離子流動，從而形成縱向電位差;當皮膚或上皮組織的完整性受到破壞、形成創(chuàng)面時，該電位差在創(chuàng)面處迅速短路，使電流從正常組織區(qū)域流向創(chuàng)面，形成電場方向指向創(chuàng)面的橫向電場，這即是創(chuàng)面內源性電場。近年研究顯示，創(chuàng)面內源性電場是指導表皮細胞定向遷移的關鍵因素，而后者

2、是創(chuàng)面愈合的前題基礎。體外實驗發(fā)現，表皮細胞能在外加持續(xù)直流電場下產生定向遷移，該現象稱為表皮細胞的電趨性。目前，國內外多數研究均采用持續(xù)直流電場作為刺激因素研究細胞的電趨性及其機制。然而，持續(xù)直流電場長時間作用將不可避免導致熱效應和電解效應等電刺激副作用，使得持續(xù)直流電場的在體應用受到限制、現有研究與臨床應用脫軌。我們前期發(fā)現，處于持續(xù)直流電場環(huán)境中的成纖維細胞去掉電場作用后，其電趨性并不會立即消失，而在一定時間內仍表現出較強的定向遷

3、移特性，提示細胞的電趨性誘導或維持并不需要持續(xù)的電刺激，進而我們推測脈沖直流電可能同樣具有誘導細胞電趨性的作用。
　　脈沖直流電場(PDCEF)是一種間斷作用的直流電場，具有場強(EF)、頻率(f)和脈寬(D)三個可變參數。與持續(xù)直流電場(CDCEF)相比，PDCEF能通過調節(jié)脈寬進而調節(jié)電場的作用時間;若低脈寬的脈沖直流電能誘導細胞電趨性，那么無疑將顯著減少電場對細胞的作用時間，減輕電場的熱效應和電解效應，從而有可能為臨床應用電

4、場促進創(chuàng)面愈合提供新的技術方法。本研究旨在探討不同參數條件下PDCEF對表皮細胞電趨性的誘導作用;通過與相同場強的CDCEF比較，評估PDCEF誘導表皮細胞電趨性的效能與副作用，為臨床應用PDCEF促進創(chuàng)面愈合奠定實驗基礎。
　　材料與方法:
　　1、乳鼠原代表皮細胞的分離、培養(yǎng)與細胞電趨性實驗模型的建立
　　取出生1-3天的Balb/c乳鼠全層皮膚，用DispaseⅡ溶液4℃孵育過夜;次日分離表皮，將其剪碎后用0.2

5、5％胰酶消化約5min，血清終止消化，反復吹打后過濾、離心;調整細胞密度至1×103后將細胞接種于細胞爬片，置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)待用。
　　將構建的電趨性小室模型浸泡于75％的酒精中30min，然后置于超凈臺紫外燈下照射30min。將接種有表皮細胞的細胞爬片置入電趨性小室，在電趨性小室兩側加細胞培養(yǎng)基各2ml，使電趨性小室中充滿培養(yǎng)基;常規(guī)構筑外加電場裝置，將構建好的細胞電趨性實驗模型置于活細胞工作站，實時動態(tài)觀察細胞

6、在電場作用下的遷移運動。
　　2、脈沖直流電場誘導表皮細胞電趨性的作用和特性分析
　　1)選取一定參數的PDCEF(EF=150mV/mm，D=60％，f=0.1Hz)作用表皮細胞3h，Image J軟件分析表皮細胞運動的方向性和速度，明確PDCEF是否具有表皮細胞電趨性誘導作用。
　　2)固定PDCEF頻率為0.1Hz、脈寬為60％，觀察場強變化(0-200mV/mm)對表皮細胞電趨性的影響。
　　3)固定PD

7、CEF頻率為0.1Hz、場強為150 mV/mm，觀察脈寬變化(0-100％)對表皮細胞電趨性的影響。由于脈寬為100％的PDCEF實質上為CDCEF，因此上述實驗可用于對比分析相同場強作用條件下PDCEF和CDCEF誘導表皮細胞電趨性的差異。
　　4)固定PDCEF場強為150 mV/mm、脈寬為60％，觀察頻率(0.001-5000000Hz)變化對細胞電趨性的影響。
　　3、脈沖和持續(xù)直流電場誘導表皮細胞電趨性和介導電

8、化學副反應的對比研究
　　1)在場強(50-250 mV/mm)相同的條件下，對比分析不同脈寬(20-80％)的PDCEF（頻率為0.1Hz）和CDCEF（脈寬為100％的PDCEF）誘導表皮細胞電趨性的差異。
　　2)分析在場強(50-250 mV/mm)相同的條件下，當不同脈寬(40-80％)的PDCEF（頻率為0.1Hz）實際作用于細胞的電刺激時間與CDCEF相同時表皮細胞電趨性差異。
　　3)在相同場強(EF=

9、150mV/mm)作用條件下，對比分析PDCEF和CDCEF對電趨性模型中溶液或細胞培養(yǎng)基pH值和mV值變化的影響，明確PDCEF和CDCEF介導電化學副反應差異。
　　結果:
　　1、乳鼠原代表皮細胞培養(yǎng)與細胞電趨性實驗模型建立
　　原代小鼠表皮細胞接種培養(yǎng)4h左右開始貼壁、伸展，細胞輪廓清晰，呈圓形或橢圓形，可見偽足伸展，折光性好，生長旺盛。構建的電趨性實驗裝置可用于活細胞工作站下實時動態(tài)觀察細胞的遷移運動;電場持

10、續(xù)作用3h，電趨性小室兩側電壓波動小，表明實驗裝置具有良好的穩(wěn)定性。
　　2、脈沖直流電場誘導表皮細胞電趨性的特性分析
　　1)在3h的觀察時間內，無電場作用的表皮細胞呈現隨機運動(方向性:-0.09±0.05);而PDCEF(EF=150mV/mm，D=60％，f=0.1Hz)作用的表皮細胞呈現明顯的向電場陰極遷移運動（方向性:0.76±0.04），同時在X軸方向上的運動速度顯著增高。時效分析顯示，施加PDCEF30分鐘內

11、，表皮細胞即表現出向電場陰極定向遷移的特性，且運動速度增加。
　　2)在固定頻率(0.1Hz)和脈寬(60％)的條件下，PDCEF誘導表皮細胞電趨性的特性與場強呈正相關;場強越高，表皮細胞的電趨性越好，表現為細胞運動的方向性和速度增加。場強為50 mV/mm時，表皮細胞向電場陰極遷移的方向性為0.35±0.05，提示該條件下PDCEF誘導表皮細胞電趨性的閾值電壓在50 mV/mm以下。
　　3)在固定頻率(0.1Hz)和場強

12、(150 mV/mm)的條件下，PDCEF誘導表皮細胞電趨性的特性與脈寬呈正相關;脈寬越大，表皮細胞的電趨性越好。脈寬為20％時，表皮細胞向電場陰極遷移的方向性為0.26±0.05，提示該條件下PDCEF誘導表皮細胞電趨性的閾值脈寬為20％左右。當脈寬達到或大于60％時，表皮細胞向陰極遷移的方向性增加不再顯著，與100％的脈寬（實質為持續(xù)直流電場）比較無顯著差異。
　　4)在固定場強(150 mV/mm)和脈寬(60％)的條件下，

13、0.001-1000Hz之內的頻率變化對PDCEF誘導的表皮細胞電趨性無顯著影響;當頻率達到5000000Hz時，表皮細胞的電趨性顯著下降。
　　3、脈沖和持續(xù)直流電場誘導表皮細胞電趨性和電化學副反應的對比研究
　　1)在場強相同的條件下，達到一定閾值脈寬的PDCEF（頻率為0.1Hz）均能誘導與CDCEF等效的電趨性。場強為50 mV/mm時，PDCEF達到與CDCEF等效電趨性的閾值脈寬為80％;場強為150 mV/mm

14、時，PDCEF達到與CDCEF等效電趨性的閾值脈寬為60％;場強為250 mV/mm時，PDCEF達到與CDCEF等效電趨性的閾值脈寬為40％。
　　2)在場強相同的條件下，當PDCEF（頻率為0.1Hz）實際作用于細胞的電刺激時間與CDCEF相同時，PDCEF較之CDCEF能以更短的實際電刺激時間誘導表皮細胞電趨性。場強為50、150和250mV/mm時，PDCEF誘導表皮細胞出現電趨性的時間分別為30min、15min和15m

15、in;而CDCEF誘導表皮細胞電趨性出現的時間分別為45min，45min和30min，提示間斷電刺激能增強表皮細胞的電趨性反應。
　　3)在場強相同的條件下，PDCEF所導致的細胞培養(yǎng)基或緩沖液pH和mV值改變顯著小于CDCEF，且隨時間的增加，這一趨勢越明顯。
　　結論:
　　1、PDCEF具有誘導表皮細胞電趨性的重要作用，其電趨性誘導效應呈場強、作用時間、脈寬和頻率依賴性。
　　2、在場強相同的條件下，達到