外加低壓穩(wěn)恒直流電場促進損傷心肌修復的實驗研究.pdf

1、1．背景與目的： 隨著人們生活水平的提高，冠心病的發(fā)病逐年增多，已成為威脅人類健康的主要疾病。藥物治療、經皮冠狀動脈介入(PCI)治療和外科冠脈旁路移植手術即冠狀動脈“搭橋”(CABG)是治療冠心病的三種手段和方法，但臨床上尚有很大一部分病例療效尚不理想。血管再生治療是目前研究的一大熱點，為缺血性心臟病尤其是那些不適合于PCI、CABG及內科藥物治療或效果極差的病人開辟了新的治療途徑。 組織損傷后傷口及其附近上皮存在的損

2、傷電流場源是一種穩(wěn)恒直流電場，具有促使損傷愈合等生物學效應。內源性電場不僅可使組織細胞分裂、增殖、向傷口定向遷移、重塑，而且可刺激血管細胞向傷口趨電遷移，損傷組織出現(xiàn)血管“發(fā)芽”再生。而血管新生、組織得以血液灌注是損傷愈合的關鍵。組織缺血性損傷后往往血管再生不足，能使血管“發(fā)芽”再生有明顯效果的電場強度為150-400 mV/mm，而缺血心肌細胞自發(fā)損傷電場為5.8mV/mm，如此弱的電場是不可能對血管生成有影響的。 因而通過電

3、刺激來促進血管新生及側支循環(huán)的形成可能翻開治療缺血性損傷的新篇章。動物實驗表明，于大鼠缺血肢體的缺血和非缺血位置施加低壓穩(wěn)恒直流電場，能使肌肉和內皮細胞VEGF表達產量明顯增加，進而大量新生血管形成，肢體缺血得以明顯改善。 此外，外加穩(wěn)恒直流電場已廣泛地成功治療各種皮膚及非皮膚損傷。研究表明，機體自身產生的生物電場不足以促進損傷愈合的進程時(如患有糖尿病，缺血性疾病)，在損傷區(qū)和未損傷區(qū)之間施加外加電場能明顯增強損傷愈合速率。

4、 然而，外加穩(wěn)恒直流電場也是否如同作用于皮膚和肢體等組織損傷一樣，于缺血(梗死)心肌的缺血和非缺血區(qū)域施加適宜的穩(wěn)恒直流電場是否也促進大量血管新生及側支循環(huán)形成?也可促進缺血(梗死)損傷心肌的修復和再生?缺血心肌血供、心室重塑及心功能是否得以改善? 電流通過組織時會產生電熱、電化學及電生理等也可能對組織有害的反應，對上述150-400mV/mm穩(wěn)恒直流電場直接作用于心臟的安全性評估，目前研究尚少。 本課題以家兔心臟

5、為研究基本模型，旨在將穩(wěn)恒直流電場用于心肌缺血(梗死)治療，對其安全性和有效性進行初步探索。 2．方法 第一部分初步探索外加穩(wěn)恒直流電場直接作用于心臟的安全范圍。 (1)將WYJ系列高精度直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電源等制作成穩(wěn)恒直流電場發(fā)生裝置，將含景99％鉑(Pt)條制成1對極身1.0cm長Pt電極。 (2)探討低壓穩(wěn)恒直流電場對組織間液的電化學作用。中國家兔10只，經心臟直接采取已肝素化動脈血代管組織間液加入希托

6、夫管中施以4.5V或6.0V穩(wěn)恒直流電電解1h。留取正常血液及電解完畢后陰極管、陽極管和中間管血液，分別測定其pH值及HCO<,3><'->、K<'+>、Na<'+>、Cl<'->、Ca<'2+>等離子濃度。 (3)探討正常家兔心臟受低壓穩(wěn)恒直流電場直接作用對心電活動及血流動力學的影響。家兔開胸后直接在心外膜上，以冠狀動脈左室支的主支下段為中線平行安放一對Pt電極，施與0～6V/cm穩(wěn)恒直流電場，監(jiān)測體表肢導聯(lián)ECG、有創(chuàng)監(jiān)測股

7、動脈血壓和左心室內壓，測量、分析ECG和血流動力學參數(shù)。 (4)探討低壓穩(wěn)恒直流電場直接作用于正常家兔心臟對心臟的電損傷。上述實驗過程中同時監(jiān)測正電極處心外膜表面溫度，光鏡和電鏡觀察心肌組織學變化。 第二部分在家兔模型梗死心肌局部施加平面和透壁兩種作用方式、2.0V和3.0V兩種強度的穩(wěn)恒直流電場，探索其促進缺血(梗死)心肌修復的有效性。 (1)在非人工通氣的情況下建立心肌缺血(梗死)實驗動物模型。10只開胸行心

8、臟冠狀動脈左室支結扎作為冠脈結扎組，5只開胸后不結扎冠脈作為假手術組。4周后處死，觀測其心電圖、血流動力學等參數(shù)和心臟組織學特征。 (2)外加低壓穩(wěn)恒直流電場促進兔梗死心肌修復效應的實驗研究。健康中國家兔40只均予冠脈結扎。隨機分配為以下5組，①心肌梗死(MI)組；②平面電場2v(PEF2V)組；③平面電場3V(PEF3V)組；④透壁電場2V(TEF2V)組；⑤透壁電場3V(TEF3V)組。分別給與相應類型和劑量的直流電場干預。

9、4周后去甲腎上腺素激發(fā)實驗分析心功能；處死動物后，測量心系數(shù)，肺系數(shù)，肝系數(shù)，肺臟濕重與干重比率，肝臟濕重與干重比率；對梗死部位心肌組織進行Masson染色，評估心肌梗死面積；評估心肌纖維化程度；免疫組織化學染色和Western Blot測定Ⅰ型膠原纖維/Ⅲ型膠原纖維的蛋白表達；CD31免疫組織化學染色檢測毛細血管密度。 (3)外加低壓穩(wěn)恒直流電場在促進兔心肌梗死模型損傷修復中的心肌細胞增殖和凋亡效應。繼續(xù)觀察上述心肌組織，Ki

10、-67核抗原標記檢測心肌細胞增殖；TUNEL法檢測心肌細胞凋亡；免疫組織化學染色和Western Blot測定心肌細胞凋亡基因相關蛋白Bcl-2/Bax的表達。 3．結果(1)改進的WYJ直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電源其電壓在0～.5V均精細可調；自制的鉑電極在電場5V/cm時電極板處電流密度最高僅為0.089 mA/cm<'2>，且作用1 h后心肌組織均無肉眼可見的組織電灼傷。 (2)6.0V以下穩(wěn)恒直流電場對組織間液的電化學作用對

11、組織的損害可以忽略不計；場強≤3.0 V/cm對ECG參數(shù)和血流動力學的影響均在安全范圍；場強≤3.5V/cm)不會出現(xiàn)電擊和組織學損傷。 (3)與冠脈假結扎組比較，冠脈結扎組其ECG和組織學特征均表現(xiàn)為心肌梗死；4周后去甲腎上腺素激發(fā)實驗心功能分析，評定心臟收縮功能的指標LVSP、+dp/dtmax和t-+dp/dtmax，冠脈結扎組降低和縮短，而冠脈結扎組評定心臟舒張功能的指標LVEDP升高、而-dp/dtmax降低。

12、 (4)心肌梗死組與各電場干預組間心、肺、肝等有關參數(shù)無統(tǒng)計學差異；去甲腎上腺素心功能激發(fā)實驗表明，PEF2V、TEF2V和TEF3V治療可改善心肌梗死后的收縮及舒張功能；在梗死面積的縮小及梗死區(qū)邊緣帶纖維化程度降低方面，透壁電場優(yōu)于平面電場；兩透壁電場還有利于ECM中膠原的重塑；TEF3V不僅可明顯促進非梗死區(qū)毛細血管的形成，而且也可促進梗死區(qū)邊緣帶和梗死區(qū)毛細血管的形成，尤以非梗死區(qū)明顯。 (5)電場干預后在非梗死區(qū)，PE

13、F2V及TEF3V均能明顯促進心肌細胞增殖；在梗死區(qū)邊緣帶，各電場干預組均表現(xiàn)明顯的心肌細胞增殖，兩透壁電場作用均優(yōu)越于兩平面電場；與心肌梗死組對照相比，僅在梗死區(qū)邊緣帶PEF2V及TEF3V對心肌細胞凋亡有明顯抑制；心肌細胞中凋亡基因相關蛋白Bcl-2和Bax主要在非梗死區(qū)和梗死區(qū)邊緣帶表達，以邊緣帶區(qū)為主。且在非梗死區(qū)和梗死區(qū)邊緣帶，Bcl-2的表達在各組間表現(xiàn)為逐步增加的趨勢；透壁電場組作用均強于平面電場組。而Bax的表達正好與之

14、相反。 4．結論 (1)改進的WYJ直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電源以及自制的鉑電極完全能滿足本課題研究的需要；場強≤3.0 V/cm的外加穩(wěn)恒直流電場對家兔心電活動、血流動力學、組織間液的電化學作用、組織學電損傷等無明顯影響，因而是安全的。 (2)根據兔心在胸腔的解剖學位置特征，在非人工通氣的情況下建立的心肌缺血(梗死)模型的制作方法，有效、簡便和實用，為電場干預實驗提供了基礎平臺。 (3)在兔模型梗死心肌局部施加平面

15、和透壁兩種作用方式、2.0V和3.0V/cm兩種強度的穩(wěn)恒直流電場。結果顯示： ①適宜的低壓穩(wěn)恒直流電場促進了血管新生和側支循環(huán)形成，縮小了梗死面積，降低了心肌纖維化程度，減輕了左心室病理的重塑，改善了左心室功能，對慢性缺血和心肌梗死模型的心肌起到了保護作用。 ②適宜的外加穩(wěn)恒直流電場可促進心肌梗死后心肌細胞增殖，抑制心肌細胞的凋亡，這可能有利于梗死后心臟的再生與功能修復。 ③總體上，透壁電場作用方式，尤以透壁電