新、陳麻黃、麻杏石甘湯熱分析研究及其對(duì)心血管系統(tǒng)的影響.pdf

1、目的:
　　 本課題通過(guò)對(duì)新、陳麻黃及組方(麻杏石甘湯)進(jìn)行熱分析研究,及研究其對(duì)心血管系統(tǒng)的影響,探討如何在發(fā)揮麻黃藥物療效的同時(shí)降低其毒副作用,從而安全、合理地使用麻黃及含麻黃制劑。
　　 方法:
　　 (1)藥材采集及制備:麻黃草樣品①2009年9月(農(nóng)歷白露前)現(xiàn)場(chǎng)采收自麻黃主產(chǎn)地之一的內(nèi)蒙古通遼市庫(kù)倫旗。②2006年產(chǎn)自內(nèi)蒙古庫(kù)倫旗。③2009年9月農(nóng)歷白露前采自內(nèi)蒙古通遼市扎魯特旗。④2007年產(chǎn)自內(nèi)

2、蒙古后旗。⑤2008年產(chǎn)自內(nèi)蒙古。⑥購(gòu)自廣東省藥材公司,批號(hào)20080103陳麻黃,該產(chǎn)品源于遼寧藥材公司向內(nèi)蒙古調(diào)貨分裝。通過(guò)水煎煮法提取麻黃及麻杏石甘湯,其間收集上沫。
　　 (2)建立毛細(xì)管電泳法(CE)測(cè)定麻杏石甘湯中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和鹽酸甲基麻黃堿的含量:采用未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱(60cm×55μm ID,有效長(zhǎng)度52cm)；以60mmol/L硼砂+10％(體積分?jǐn)?shù))甲醇(pH9.0)為運(yùn)行緩沖液；分離電

3、壓12kV；重力進(jìn)樣10s(高度15cm)；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；以鹽酸小檗堿為內(nèi)標(biāo),測(cè)定以不同采集時(shí)間的麻黃制成的麻杏石甘湯中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和鹽酸甲基麻黃堿的含量。
　　 (3)新麻黃草、陳麻黃草的熱分析TG-DTG-DSC及Py(熱解)-GC-MS研究:
　　 取不同產(chǎn)地或不同采收時(shí)間的麻黃草粉末,置于Al2O3坩堝中。按實(shí)驗(yàn)條件程序升溫,對(duì)樣品進(jìn)行TG-DSC測(cè)試。測(cè)量范圍:30～1000℃；升溫速率:10

4、℃·min-1；氮?dú)鈿夥张c空氣氣氛；以Al2O3坩堝做基線,得到TG-DTG-DSC譜圖。
　　 Py-GC-MS分析,取不同年份的麻黃草粉末置進(jìn)樣器,進(jìn)入熱解器中,熱解后通過(guò)GC-MS檢測(cè)。以06年麻黃草在400℃、500℃、600℃條件下熱解篩選最佳溫度條件,確立熱解溫度500℃,熱解時(shí)間為10 s；GC起始柱溫50℃,程序升溫8℃·min-1,至240℃,保持10 min,進(jìn)樣口溫度250℃,載氣He,柱前壓60 kPa；

5、EI離子源,電子能量70 eV,掃描范圍29-550 u,四極桿溫度150℃,離子源溫度230℃,電子倍增器電壓1500V,GC/MS接口溫度280℃。
　　 (4)新麻黃水提物、陳麻黃水提物、麻杏石甘湯水提物及杏石甘水提物的熱分析TG-DTG-DSC及Py-GC-MS研究:取新麻黃、陳麻黃、麻杏石甘湯水提浸膏于0℃條件下真空干燥,磨成粉末,氮?dú)鈿夥张c空氣氣氛條件下,分別對(duì)樣品進(jìn)行TG-DSC測(cè)試。測(cè)試條件同(3)。Py-GC-

6、MS分析,取新麻黃、陳麻黃水提物、麻杏石甘湯水提物及杏石甘水提物粉末進(jìn)行Py-GC-MS檢測(cè)。以麻黃水提浸膏粉末在400℃、500℃、600℃條件下熱解篩選最佳裂解溫度條件,確立熱解溫度500℃,熱解時(shí)間為10 s；GC—MS測(cè)定條件同(3)。
　　 (5)麻黃“上沫”成分的熱分析TG-DTG-DSC及Py-GC-MS研究:在麻黃水煎過(guò)程中,收集麻黃“上沫”于0℃條件下真空干燥,磨成粉末,空氣氣氛條件下對(duì)樣品進(jìn)行TG-DSC測(cè)試

7、。測(cè)試條件同(3)。Py-GC-MS分析,確立熱解溫度450℃,熱解時(shí)間為10 s；GC—MS測(cè)定條件同(3)。
　　 (6)新麻黃、陳麻黃及麻杏石甘湯對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響:將大鼠麻醉后,分離左頸總動(dòng)脈插入導(dǎo)管,管內(nèi)使用50IU/ml肝素-生理鹽水抗凝,導(dǎo)管連接于生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)上,并按常規(guī)導(dǎo)聯(lián)在大鼠皮下插入微型電極,手術(shù)后穩(wěn)定30分鐘,記錄各項(xiàng)指標(biāo)作為給藥前正常值,分別灌胃給藥,記錄各組給藥后0.5、1、2、3h血壓變

8、化、心率變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用重復(fù)測(cè)量分析和單向方差分析處理。
　　 (7)新麻黃、陳麻黃及麻杏石甘湯對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈血管環(huán)的影響:取大鼠胸主動(dòng)脈,去除周圍結(jié)締組織后將血管剪成約3～4mm的血管環(huán),調(diào)節(jié)靜息張力為1.15g,穩(wěn)定1.5h,分別加入不同濃度的新麻黃水提液、陳麻黃水提液、新麻杏石甘水提液、陳麻杏石甘水提液,記錄血管張力的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用重復(fù)測(cè)量分析和單向方差

9、分析處理。
　　 (8)新麻黃、陳麻黃及麻杏石甘湯對(duì)大鼠心肌亞急性毒性的作用研究:分別灌胃給予大鼠不同濃度的新麻黃水提液、陳麻黃水提液、新麻杏石甘水提液、陳麻杏石甘水提液、杏石甘水提液,連續(xù)給藥15天。于大鼠給藥7天、15天分離血清測(cè)定肌酸激酶同工酶CK-MB、乳酸脫氫酶LDH。給藥后15天,摘取心臟,用10％甲醛固定,HE染色,作病理組織學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用重復(fù)測(cè)量分析和單向方差分析處理。

10、　　 (9)新麻黃、陳麻黃及麻杏石甘湯對(duì)大鼠離體心臟的作用研究:將大鼠處死后,取心臟,置Langendorff離體心臟灌流裝置上,將水囊插入左心室,安置心電引導(dǎo)電極,穩(wěn)定后,灌流充氧的含藥樂(lè)氏液,觀察給藥后左心室壓力、心率和冠脈流量的變化。
　　 結(jié)果:
　　 (1)毛細(xì)管電泳法測(cè)定麻杏石甘湯中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和鹽酸甲基麻黃堿的含量:鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和鹽酸甲基麻黃堿濃度分別在20.0～160.0μg/m

11、L(r=0.9999)、7.5～60.0μg/mL(r=0.9991)、2.0～10.0μg/mL(r=0.9993)內(nèi)線性關(guān)系良好,三種成分的平均加樣回收率依次為98.0％、97.0％、97.8％,方法精密度(RSD)依次為2.31％、2.21％、2.00％(n=6)。庫(kù)倫09麻黃配伍的麻杏石甘湯鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿的含量為3.69mg/mL、1.12mg/mL、0.32 mg/mL；庫(kù)倫06麻黃配伍的麻杏石甘湯鹽

12、酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿的含量為3.89mg/mL、0.84mg/mL、0.42 mg/mL。
　　 (2)新麻黃草、陳麻黃草的熱分析TG-DTG-DSC及Py-GC-MS研究:
　　 新采麻黃草或陳麻黃草,在N2氣氛中,其TG曲線均有五個(gè)階梯,不同產(chǎn)地、不同時(shí)間的麻黃草DTG曲線、TG曲線都極其相似,此曲線圖形似可作為內(nèi)蒙東部草麻黃的特征熱重譜圖。從DSC曲線的變化來(lái)看,同一采樣點(diǎn),新采集的草麻黃藥材與放

13、陳的草麻黃藥材,其組成是有差異的。在空氣氣氛下,內(nèi)蒙草麻黃草藥材無(wú)論新采或放置不同年份的麻黃,均有五階梯的失重區(qū)間、它們的DTG出現(xiàn)五個(gè)明顯的失重峯,其DTG、TG曲線是極相似的,此曲線也似可作為內(nèi)蒙草麻黃的特征熱重譜圖。從DSC曲線計(jì)算其能量變化的代數(shù)和,新采麻黃草的能量變化在6000 J.g-1左右,而放陳一年以上的麻黃草能量變化均在7000 J.g-1以上。
　　 對(duì)Py-GC-MS分離出來(lái)的化合物進(jìn)行圖譜解析,庫(kù)倫06草

14、麻黃草及庫(kù)倫09草麻黃草,均檢測(cè)出33種化合物,這33種化合物名稱相同,但各種化合物的相對(duì)百分含量完全不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在本研究的特設(shè)實(shí)驗(yàn)條件下,草麻黃草藥材Py-GC-MS產(chǎn)物應(yīng)是草麻黃草藥材的定向裂解分解產(chǎn)物,它代表了這種藥材組成的特定指紋。
　　 (3)新麻黃、陳麻黃水提物、麻杏石甘湯水提物及杏石甘水提物的熱分析TG-DTG-DSC及Py-GC-MS研究:各種水提物在200～500℃表示出它們的特征譜圖,麻杏石甘湯譜圖表現(xiàn)

15、為麻黃譜圖和杏石甘譜圖的共同特征,但有一定的變化。
　　 Py-GC-MS分析決定水提取物的裂解溫度為500℃,在此條件下,新麻黃水提物解析出58種化合物,陳麻黃水提物解析出35種化合物,新麻杏石甘湯水提物解析出33種化合物,陳麻杏石甘湯解析出40種化合物,杏石甘方解析出42種化合物。
　　 (4)麻黃“上沫”成分的熱分析TG-DTG-DSC及Py-GC-MS研究:在空氣氣氛的加熱條件下,“上沫”最后未見(jiàn)有殘?jiān)?坩堝重量

16、與進(jìn)樣前一致。
　　 對(duì)麻黃“上沫”的Py-GC-MS分離的化合物進(jìn)行圖譜解析,確認(rèn)了28種化學(xué)成分,醛類化合物相對(duì)含量占59.53％。
　　 (5)新麻黃、陳麻黃及麻杏石甘湯對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響:新麻黃高劑量組給藥后MAP、SAP、DAP、HR均出現(xiàn)升高趨勢(shì)；新麻杏石甘湯高劑量在30分鐘至60分鐘時(shí)間段MAP、SAP、DAP、HR也出現(xiàn)升高趨勢(shì),但作用不如新麻黃高劑量組明顯；新麻黃低劑量組與陳麻黃高劑量組隨著時(shí)間的延

17、長(zhǎng)出現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì),與生理鹽水組相似。
　　 給藥后30分鐘至60分鐘,新麻黃高劑量組與生理鹽水對(duì)照組比較,血壓出現(xiàn)明顯上升(P<0.01)；與陳麻黃組相比,血壓上升幅度明顯(P<0.05)；新麻杏石甘湯在給藥30分鐘后SAP升高幅度明顯低于新麻黃(P=0.016),其它時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)無(wú)明顯差異(P>0.05)。給藥后30分鐘,陳麻黃SAP上升幅度明顯高于生理鹽水對(duì)照組(P=0.036),新麻杏石甘湯的SAP、MAP與生理鹽水組比

18、較也有明顯上升(P<0.05)；給藥60分鐘后,陳麻黃,新麻杏石甘湯與生理鹽水組比較各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。新麻黃低劑量組在給藥后各時(shí)間點(diǎn)SAP、DAP、MAP、HR均低于新麻黃高劑量組,呈劑量依賴性關(guān)系。
　　 除了新麻黃高劑量組在給藥后60分鐘心率加快與生理鹽水對(duì)照組有顯著性差異外(P=0.044),其余各組在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 (6)新麻黃、陳麻黃及麻杏石甘湯對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)

19、脈血管環(huán)的影響:當(dāng)濃度為0.2 g/L～0.4 g/L范圍時(shí),新麻黃、陳麻黃、新麻杏石甘湯與陳麻杏石甘湯均對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈呈收縮作用。在0.2g/L時(shí),新麻黃與陳麻黃相比,對(duì)血管的收縮作用更明顯(P=0.005)。當(dāng)濃度為0.4 g/L時(shí),新麻黃與陳麻黃、新麻杏石甘湯相比,對(duì)血管的收縮作用更明顯(P值均為0.000)；當(dāng)濃度為0.4g/L～9.6g/L范圍時(shí),新麻黃、陳麻黃、新麻杏石甘湯與陳麻杏石甘湯均對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈的呈舒張作用。

20、在0.8g/L～2.4 g/L時(shí),陳麻黃比新麻黃對(duì)血管的舒張作用更明顯(P<0.05)。當(dāng)濃度為2.4 g/L～4.8 g/L時(shí),陳麻黃舒張作用比陳麻杏石甘湯更明顯(P=0.032),其余各組無(wú)顯著性差異。
　　 (7)大鼠給藥7天,新麻黃高劑量組、新麻杏高劑量組出現(xiàn)毛發(fā)蓬松,精神狀態(tài)與活動(dòng)狀態(tài)較差。各組給藥6天后,除空白給水組外,其余各給藥劑量組均不同程度出現(xiàn)眼睛晶狀體渾濁,眼眶滲紅色分泌物現(xiàn)象。
　　 給藥7天后,動(dòng)

21、物體重均有顯著性增加(P=0.000),給藥15天后,除新麻杏低劑量組、陳麻杏低劑量組與杏石甘對(duì)照組與空白組的體重變化無(wú)差異外(P>0.05),其余給藥組的體重增加速度明顯低于空白對(duì)照組((P<0.01,P<0.05)。新麻黃高劑量組與新麻杏石甘湯高劑量組體重增長(zhǎng)速度均低于其他各給藥組。
　　 末次給藥后處死并解剖動(dòng)物時(shí)發(fā)現(xiàn)新麻黃高劑量組大鼠肝臟色澤偏黑,沒(méi)有光澤,與空白組比較差異明顯。
　　 連續(xù)灌胃給藥7天和15天后

22、,麻黃各劑量組與麻杏石甘各劑量組大鼠血清中心肌酶與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 心肌組織病理形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果:檢測(cè)各劑量組的心臟,以NS組和組方陰性組為對(duì)照組和溶劑對(duì)照組,各個(gè)劑量組均未見(jiàn)明顯的心肌自發(fā)性病理改變；各個(gè)劑量組未見(jiàn)心肌壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌脂肪變性、心內(nèi)膜增生等改變；未見(jiàn)有粥樣硬化、血栓形成等改變；各個(gè)劑量組心肌纖維的寬度未見(jiàn)有明顯的差異。
　　 (8)新麻黃高劑量組對(duì)大鼠離體心臟左室收

23、縮壓升高幅度大于同等劑量陳麻黃、新麻杏石甘等給藥組；新麻杏石甘高劑量組對(duì)左室收縮壓的影響隨時(shí)間增加而升高；陳麻黃高劑量組、陳麻杏石甘高劑量組、陳麻杏石甘低劑量組、新麻黃低劑量組、新麻杏石甘湯低劑量組、空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)趨勢(shì)近似。新麻黃高劑量組對(duì)大鼠離體心臟左室舒張末壓升高幅度低于同等劑量陳麻黃、新麻杏石甘。新、陳麻黃單方均對(duì)心率有升高趨勢(shì),組方成麻杏石甘湯后可降低同等劑量麻黃單方的影響,可能與杏石甘可略減緩心率有關(guān)?？瞻讓?duì)照組冠脈流量隨

24、時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢降低,各給藥組變化率在20％左右,但相對(duì)于空白對(duì)照組有所提高。
　　 結(jié)論:
　　 (1)采用CE法同時(shí)測(cè)定麻杏石甘湯中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、和鹽酸甲基麻黃堿三種成分的含量,方法快速、簡(jiǎn)便,儀器要求不高,為更好的控制該制劑的質(zhì)量提供新的依據(jù)。
　　 (2)熱重分析(TG-DTG)和差示掃描量熱(DSC)分析法應(yīng)用于植物性中藥藥材的鑒別是快速,簡(jiǎn)便、直接的方法,其所顯示的藥材譜線雖因產(chǎn)地、存貯時(shí)間

25、不同略有差別,但其主要特征是一樣的,同一樣品的譜圖重現(xiàn)性好,數(shù)據(jù)穩(wěn)定,所以,可認(rèn)為是一種可靠的特征譜圖。所確立的內(nèi)蒙草麻黃藥材的特征熱譜圖似可作為該地草麻黃藥材真品鑒別的參考依據(jù)。
　　 研究結(jié)果表明,所研究的六種草麻黃草藥材均是產(chǎn)自內(nèi)蒙東部科爾沁沙地的同源草麻黃。
　　 以Py-GC-MS方法研究麻黃草藥材,認(rèn)為可得到該藥材在特定實(shí)驗(yàn)條件下定向裂解的訊息,也就是它的特征指紋。研究首次以數(shù)據(jù)闡述了“陳”“新”麻黃藥材的內(nèi)

26、涵和差別。以Py-GC-MS研究植物性中藥藥材仍屬于起步性工作。熱解吸法可以把植物中的揮發(fā)組分解吸出來(lái),而熱裂解手段是把植物中不易揮發(fā)的大分子化合物如蛋白質(zhì),纖維素、多糖、生物堿、苷類等裂解成小分子化合物,然后通過(guò)氣相色譜分離,質(zhì)譜檢測(cè)獲得豐富的指紋信息。雖然植物成份受到破壞,但由于不同植物所含的化合物不同,這些化合物在特定條件下有其特征的裂解行為、特征的裂解產(chǎn)物,因而可以提供特征的指紋信息,從而通過(guò)其圖譜去分辨不同的植物藥材。

27、　　 (3)無(wú)論新麻杏石甘湯或陳麻杏石甘湯的提取物,從熱譜中都可看出保持有麻黃和杏石甘提取物原有DTG和DSC譜圖特征,譜圖特征是兩種譜圖特征的復(fù)合,但又有一定變化,預(yù)示化學(xué)組成有一定的變化,尤其DSC曲線變化反映,可能有些溶出組分產(chǎn)生了離子對(duì)化合物、絡(luò)合物、復(fù)合物或沉淀。以Py-GC-MS方法組方提取物的冷凍干燥粉末,結(jié)果顯示各藥味配伍后,其水提液中的熱解產(chǎn)物化學(xué)成分有一定的變化,而相同化學(xué)成分的相對(duì)百分含量也發(fā)生改變,預(yù)示藥液的原

28、始化學(xué)成分的改變,提示麻杏石甘湯中的藥味在煎煮過(guò)程中有一定的化學(xué)反應(yīng)。以Py-GC-MS及TG、DTG、DSC數(shù)據(jù)證明麻黃藥材陳置使其水提取液的化學(xué)成分產(chǎn)生一定的變化,從而使其藥性也發(fā)生一定變化。以數(shù)據(jù)證明陳麻杏石甘湯與新麻杏石甘湯的水提取液內(nèi)涵的差異,從而從內(nèi)涵上去解釋了它的藥理、藥效作用的不同。
　　 (4)首次研究了麻黃“上沫”的內(nèi)涵,麻黃“上沫”為有機(jī)化合物,為麻黃入藥需先煎去“上沫”的制法提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。
　

29、　 (5)大鼠灌胃給藥后,血壓升高幅度:新麻黃高劑量>新麻杏石甘湯高劑量>陳麻黃高劑量。給藥120分鐘后,各組無(wú)顯著性差異。結(jié)果提示麻黃在放陳后或組方成麻杏石甘湯會(huì)降低麻黃升高血壓的作用。
　　 (6)小劑量范圍內(nèi)(<0.4g/L),新麻黃對(duì)離體大鼠主動(dòng)脈的收縮作用明顯強(qiáng)于陳麻黃、新麻杏石甘湯。大劑量范圍內(nèi)(0.4g/L～9.6g/L),陳麻黃對(duì)血管的舒張作用比新麻黃更明顯。新麻杏石甘湯與陳麻杏石甘湯相比,兩者對(duì)血管的收縮與舒

30、張無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明在一定的濃度范圍,麻黃放陳后或通過(guò)組方可降低新麻黃單方對(duì)血管的收縮作用。
　　 (7)麻黃各組在短時(shí)間給藥(相當(dāng)于一般臨床用藥2～3倍時(shí)間),心肌未見(jiàn)明顯變化,說(shuō)明麻黃短時(shí)間給藥對(duì)心臟沒(méi)有影響。但給藥期間體重的變化、眼睛的外觀變化及肝臟外觀的變化提示高劑量的麻黃對(duì)大鼠可能在其他臟器有一定的毒性作用,尚待進(jìn)一步研究。
　　 (8)麻黃放陳或組成麻杏石甘湯對(duì)大鼠離體心臟左心室內(nèi)壓的作用有一定降低,但中