高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠肝臟Mfn2表達(dá)與線粒體功能.pdf

1、目的：研究高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠肝臟中線粒體融合蛋白2(Mitofusin2：Mfn2)的表達(dá)及線粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化情況；以明確Mfn2的表達(dá)與線粒體結(jié)構(gòu)、功能的關(guān)系，為研究胰島素抵抗的分子機(jī)制提供實(shí)驗依據(jù)。
　　方法：本研究以4周齡SD大鼠為研究對象，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常飲食組20只和高脂飲食組20只。
　　1通過高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠構(gòu)建胰島素抵抗的動物模型：正常飲食組給予普通飼料(熱量組成：脂肪10.3％

2、，蛋白質(zhì)24.2％，碳水化合物65.5％，總熱量為348 kcal/100 g)；高脂飲食組給予高脂飼料(熱量組成：脂肪59.8％，碳水化合物20.1％，蛋白質(zhì)20.1％，總熱量為501 kcal/100 g)。
　　2在喂養(yǎng)4周時，每組隨機(jī)選取10只大鼠行高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗檢測胰島素抵抗程度，鉗夾實(shí)驗結(jié)束后進(jìn)行下述指標(biāo)檢測。
　　2.1常規(guī)指標(biāo)檢測：采用葡萄糖氧化酶法測尾尖空腹血糖；采用酶聯(lián)免疫法測血清中空腹胰島素的

3、水平；采用生化法測血清中膽固醇和甘油三酯的含量。
　　2.2線粒體結(jié)構(gòu)功能檢測：采用HE染色觀察肝臟細(xì)胞形態(tài)變化；采用透射電鏡觀察肝臟線粒體結(jié)構(gòu)變化；采用比色法測定肝臟組織線粒體懸液中琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C氧化酶的活性。
　　2.3 Mfn2檢測：采用Real-time RT-PCR檢測肝臟中線粒體融合蛋白2的mRNA表達(dá)情況；采用Western blot檢測肝臟中線粒體融合蛋白2的蛋白含量。
　　3繼續(xù)喂養(yǎng)剩余的大

4、鼠到8周時，再次行高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗檢測胰島素抵抗程度，鉗夾實(shí)驗結(jié)束后處死剩余的大鼠，重復(fù)上述指標(biāo)檢測。
　　結(jié)果：
　　1喂養(yǎng)4周后高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗結(jié)果顯示：高脂飲食組葡萄糖輸注率24.25±0.87mg/(kg.min)低于正常飲食組25.20±0.61mg(kg.min)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組大鼠體重、空腹血糖、膽固醇及甘油三酯含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高脂飲食組空腹胰島素的

5、含量28.08±0.65mU/L高于正常飲食組26.30±0.85mU/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　2喂養(yǎng)8周后高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗結(jié)果顯示：高脂飲食組葡萄糖輸注率19.39±0.88mg/(kg.min)低于正常飲食組24.75±1.47 mg/(kg.min)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；兩組體重差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高脂飲食組空腹血糖的水平5.09±0.15mmol/L高于正常飲食組4

6、.85±0.09mmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；高脂飲食組膽固醇的水平1.25±0.11mmol/L高于正常飲食組1.07±0.15mmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；高脂飲食組甘油三酯的水平0.64±0.05mmol/L高于正常飲食組0.52±0.05mmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；高脂飲食組空腹胰島素的含量27.71±0.93mU/L高于正常飲食組22.87±1.24mU/L，差異有統(tǒng)計學(xué)

7、意義(P<0.01)。
　　3肝臟HE染色結(jié)果顯示：4周時正常飲食組中肝細(xì)胞形態(tài)正常，體積正常；高脂飲食組肝臟細(xì)胞部分出現(xiàn)脂肪變性，細(xì)胞體積有所增大，胞質(zhì)中可見部分空泡變性。8周時正常飲食組中肝細(xì)胞形態(tài)及體積均正常，未見炎性細(xì)胞浸潤；高脂飲食組肝臟細(xì)胞出現(xiàn)彌漫性脂肪變性，以中央靜脈區(qū)最為明顯，細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)中可見空泡變性，中央靜脈區(qū)可見炎性細(xì)胞浸潤。
　　4肝臟透射電鏡結(jié)果顯示：4周時正常飲食組肝細(xì)胞中線粒體內(nèi)外膜清晰可

8、見，線粒體嵴形態(tài)正常，排列規(guī)則，胞質(zhì)中未見脂滴；高脂飲食組肝細(xì)胞胞核周圍可見散在脂滴，線粒體內(nèi)外膜清晰可見，線粒體嵴出現(xiàn)部分融合。8周時正常飲食組肝細(xì)胞中線粒體形態(tài)清晰可見，線粒體內(nèi)外膜清晰可見，線粒體嵴形態(tài)正常；高脂飲食組肝細(xì)胞胞核周圍可見體積較大的脂滴，線粒體內(nèi)外膜出現(xiàn)部分或全部融合，線粒體嵴全部消失，呈現(xiàn)空泡化表現(xiàn)。
　　5反映線粒體功能的兩個關(guān)鍵酶活性測定結(jié)果：4周時高脂飲食組琥珀酸脫氫酶的活性9.203±1.549U/m

9、g.prot，低于正常飲食組琥珀酸脫氫酶的活性11.795±1.829 U/mg.prot，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；高脂飲食組細(xì)胞色素C氧化酶活性1.368±0.170umol/mg.prot與正常飲食組細(xì)胞色素C氧化酶活性1.431±0.157 umol/mg.prot)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。8周時高脂飲食組中琥珀酸脫氫酶的活性8.113±0.925U/mg.prot，低于正常飲食組琥珀酸脫氫酶活性10.98

10、5±1.044 U/mg.prot，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；高脂飲食組細(xì)胞色素C氧化酶的活性0.659±0.237 umol/mg.prot，低于正常飲食組細(xì)胞色素C氧化酶的活性1.364±0.122 umol/mg.prot，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　6采用Real-time RT-PCR檢測肝臟中Mfn2的mRNA表達(dá)情況結(jié)果顯示：4周時高脂飲食組Mfn2的表達(dá)(1.124±0.253)低于正常飲食組(

11、1.784±0.256)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；8周時高脂飲食組Mfn2的表達(dá)(0.369±0.129)低于正常飲食組(1.261±0.322)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　7采用western blot檢測肝臟中Mfn2的蛋白表達(dá)情況結(jié)果顯示：4周時高脂飲食組Mfn2的蛋白含量(0.441±0.063)低于正常飲食組(0.577±0.083)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；8周時高脂飲食組Mfn2的蛋

12、白含量(0.334±0.056)低于正常飲食組(0.524±0.060)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1隨著高脂飲食誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗的加重，肝細(xì)胞脂肪變性明顯增加，肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)受到損害加重。
　　2隨著高脂飲食誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗的加重，反映肝細(xì)胞線粒體功能的琥珀酸脫氫酶及細(xì)胞色素C氧化酶活性逐漸降低。
　　3高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠，肝細(xì)胞線粒體融合蛋白2的mRNA表達(dá)及蛋白含量