線粒體融合蛋白2對高脂飲食誘導的胰島素抵抗大鼠骨骼肌脂肪代謝的影響.pdf

1、胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)是指外周組織（骨骼肌、脂肪和肝臟）對胰島素的敏感性降低，表現(xiàn)為外周組織對葡萄糖的攝取和利用障礙。近年來研究認為，骨骼肌組織內脂代謝中間產物如甘油二酯、神經酰胺、長鏈脂酰輔酶A的沉積增加是誘導骨骼肌產生IR的主要原因。
　　 脂肪酸是人及哺乳動物的主要能源物質，脂肪酸的攝入超出其氧化能力是骨骼肌內脂肪堆積的主要原因。脂肪酸轉位酶(fatty acid translocase，

2、CD36)是促進骨骼肌細胞攝取脂肪酸的重要膜蛋白。進入細胞中的脂肪酸需進入線粒體內進行代謝，肉堿脂酰轉移酶(camitine palmitoyltransferase 1，CPTl)在脂肪酸由胞液向線粒體基質的轉運中起關鍵作用。
　　 胰島素抵抗及脂質沉積發(fā)病機理的關鍵因子之一是線粒體功能受損，而線粒體融合蛋白2（mitofusin2，MFN2）對線粒體功能有重要的影響。越來越多的研究表明MFN2表達與胰島素抵抗狀態(tài)相關，但具體

3、機制仍不清楚。本研究通過高脂飲食構建大鼠胰島素抵抗模型，用MFN2腺病毒進行干預，探討MFN2是否可通過改善線粒體功能，增加CPT1的表達，從而減少骨骼肌脂質代謝中間產物的沉積，進而改善胰島素抵抗。
　　 目的:探討MFN2對高脂飲食誘導的胰島素抵抗大鼠骨骼肌脂質沉積及脂肪酸代謝中CD36及CPT1的影響極其機制。
　　 方法:64只雄性SD大鼠隨機分為2組，正常對照組(8N)16只、高脂飲食組(8F)48只，正常對照組

4、給予普通飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組給予高脂飼料喂養(yǎng)8周，應用清醒狀態(tài)下高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗判斷高脂飲食誘導胰島素抵抗模型成功，之后各組隨機選取8只大鼠，腹主動脈取血處死動物，血糖(blood glucose，BG)應用快速血糖儀測定;血甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)應用全自動生化分析儀測定;ELISA試劑盒測定血清胰島素(insulin，INS)，骨骼肌甘油二酯(diacy

5、lglycerols，DAG)、神經酰胺(ceramides，CEA)、長鏈脂酰輔酶A(long chain fatty acid CoAs，LCACoAs)的變化;GPO-PAP酶法測定骨骼肌甘油三酯含量的變化;透射電鏡觀察大鼠骨骼肌線粒體形態(tài)變化;用RT-PCR和Westernblot的方法分析大鼠骨骼肌CD36及CPT1的mRNA和蛋白的表達。之后將剩余高脂飲食組大鼠隨機分為:高脂對照組(Control)、空病毒組(Ad)、MFN

6、2低劑量組(Ad-MFN2108)、MFN2中劑量組(Ad-MFN2109)、MFN2高劑量組(Ad-MFN21010)各8只，分別應用PBS、MFN2空病毒或不同劑量MFN2腺病毒鼠尾靜脈注射干預三周，高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗評估各組大鼠胰島素抵抗程度，之后處死各組大鼠，BG應用快速血糖儀測定;TG、TC應用全自動生化分析儀測定;ELISA試劑盒測定INS，骨骼肌DAG、CEA、LCACoAs的變化;GPO-PAP酶法測定骨骼肌甘油三

7、酯含量的變化;電鏡觀察大鼠骨骼肌線粒體形態(tài)變化;RT-PCR和Westernblot的方法分析大鼠骨骼肌CD36及CPT1的mRNA和蛋白的表達。
　　 結果:1、高脂飲食喂養(yǎng)8周，指標變化:(1)胰島素抵抗大鼠模型制作成功:高脂飲食喂養(yǎng)8周后，高脂組BG[(7.2±0.6vs5.7±0.7)mmol/L]及INS[(40.6±3.9vs28.7±3.3)mU/L]明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），葡萄糖輸注

8、率(GIR)明顯低于正常對照組[(17.7±2.3vs29.4±2.4)mg/kg/min]，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。(2)血脂水平的變化:高脂飲食喂養(yǎng)8周后，高脂組大鼠血TC[(1.51±0.07vs1.13±0.06)mmol/L]，TG[(0.35±0.04vs0.22±0.02)mmol/L]明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。(3)大鼠骨骼肌線粒體形態(tài)的變化:正常對照組肌細胞中細胞器結構完好，線粒體

9、豐富，胞漿內無脂滴及脫顆粒現(xiàn)象，線粒體膜、嵴結構完整，排列規(guī)則;高脂組肌細胞內可見大量大小不等的脂滴分布，線粒體有一定程度的腫脹，內外膜部分融合，線粒體嵴變少變短，部分或全部消失，甚至出現(xiàn)空泡化。(4)骨骼肌脂質沉積結果:高脂飲食喂養(yǎng)8周后，與正常飲食對照組相比，高脂組骨骼肌組織中甘油三酯[(27.9±1.8vs9.6±0.9)μmol/g]，甘油二酯[(563.0±48.3vs211.5±31)nmol/g]，神經酰胺[(130.3±

10、9.3vs67.2±12.2)nmol/g]，LCACoAs[(6.0±0.8vs2.2±0.31)nmol/g]的含量均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。(5)CD36、MFN2及CPT1的mRNA和蛋白的表達:高脂組骨骼肌組織中CD36mRNA和蛋白的表達均高于對照組(P＜0.01)，CPT1、MFN2的mRNA和蛋白的表達較正常對照組明顯下降(P＜0.01)。
　　 2、MFN2干預3周后，指標變化:(1)胰島素

11、抵抗程度的變化:MFN2干預3周后，MFN2干預組骨骼肌組織中MFN2mRNA和蛋白的表達與空病毒組相比明顯升高(P＜0.01);MFN2干預組GIR明顯高于空病毒組[(Control:17.74±2.34,Ad:17.91±2.56,Ad-MFN2108:24.27±3.97,Ad-MFN2109:28.16±4.71,Ad-MFN21010:29.22±3.18)mg/kg/min],BG[(Control:7.18±0.6，Ad:

12、7.2±0.7，Ad-MFN2108:6.2±0.5，Ad-MFN2109:5.9±0.7，Ad-MFN21010:5.8±0.8)mmol/L]及INS[(Control:40.0±5.9，Ad:40.1±5.9，Ad-MFN2108:32.7±3.9,Ad-MFN2109:30.9±3.7,Ad-MFN21010:30.7±3.1)mU/L]均明顯下降(P＜0.01)。(2)大鼠血脂水平的變化:與空病毒組相比，MFN2干預組大鼠血T

13、G[(Control:0.14±0.015，Ad:0.13±0.01，Ad-MFN2108:0.12±0.01,Ad-MFN2109:0.11±0.01,Ad-MFN21010:0.11±0.01)mmol/L]及TC[(Control:1.13±0.1,Ad:1.09±0.09,Ad-MFN2108:1.03±0.11,Ad-MFN2109:1.00±0.08，Ad-MFN21010:1.02±0.04)mmol/L]無明顯變化(P＞

14、0.05)。(3)大鼠骨骼肌電鏡結果:Ad-MFN2不同劑量干預組與空病毒組相比脂滴數(shù)量少，線粒體腫脹減輕，內外膜部分融合。(4)大鼠骨骼肌脂質沉積結果:MFN2干預組DAG[(Control:562.5±60.4，Ad:547.3±69.6，Ad-MFN2108:437.8±63.4,Ad-MFN2109:369.7±66.5,Ad-MFN21010:355.5±48.8)nmol/g]、CER[(Control:134.2±11.1

15、,Ad:138.3±12.4,Ad-MFN2108:87.8±10.9,Ad-MFN2109:84.8±14.9,Ad-MFN21010:75.7±12.2)nmol/g]、LCACoAs[(Control:6.6±0.8,Ad:6.4±0.7,Ad-MFN2108:3.8±0.6,Ad-MFN2109:3.0±0.6,Ad-MFN21010:2.1±0.5)nmol/g]的含量明顯下降(P＜0.01)，甘油三酯的含量無明顯變化[(Co

16、ntrol:24.3±3.1，Ad:23.1±3.2，Ad-MFN2108:21.1±3.0，Ad-MFN2109:19.5±2.2,Ad-MFN21010:20.1±2.3)μmol/g](P＞0.05)。(5)CD36及CPT1的mRNA和蛋白的表達:MFN2干預各組CD36的mRNA和蛋白的表達與空病毒組相比無明顯變化;MFN2干預各組CPT1mRNA和蛋白的表達與空病毒組相比明顯升高(P＜0.01)。
　　 結論:

17、>　　 1、高脂飲食使大鼠空腹血糖及胰島素升高，葡萄糖輸注率明顯下降，造成胰島素抵抗，MFN2干預可改善高脂飲食引起的大鼠胰島素抵抗。
　　 2、高脂飲食導致線粒體腫脹，內外膜部分融合，線粒體嵴變少變短，部分或全部消失，甚至出現(xiàn)空泡化;MFN2干預后線粒體超微結構損傷減輕。
　　 3、高脂飲食導致大鼠高甘油三酯血癥及高膽固醇血癥，并導致骨骼肌脂質及其中間代謝產物的沉積，MFN2干預可改善高脂飲食引起的骨骼肌脂質沉積，而