HGF基因修飾BMSCs治療早期股骨頭缺血性壞死的研究.pdf

1、股骨頭缺血性壞死（avascularnecrosisofthefemoralhead，ANFH）是臨床多發(fā)病和常見病，致殘率極高，多見于20-50歲青壯年，嚴重影響患者的生活質量和勞動能力，給社會和家庭造成巨大負擔。據世界衛(wèi)生組織不完全統計，全世界約有3000萬人患有此病;我國患者約500-750萬，每年新發(fā)病例15-20萬，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。ANFH目前尚無特效療法，已成為世界醫(yī)學界亟待攻克的難題。尋找新的有效的早期治療方法、保存

2、自身股骨頭顯得尤為重要，其潛在的社會和經濟效益不言而喻。
　　 不論何種病因引起的ANFH，其根本原因是存在骨內壓升高→血供障礙這一惡性循環(huán)。一般認為本病是一不可逆過程，因此，ANFH的治療策略應該是早期治療，降低骨內壓、改善股骨頭血供，打破惡性循環(huán)，同時進行壞死區(qū)骨質修復。利用血管生長因子誘導新血管生成和側枝循環(huán)建立，是打破ANFH病理惡性循環(huán)最有效的手段，這也為ANFH治療提供了新的研究方向。
　　 血管生長因子是一

3、組可以誘導血管生成的細胞因子。不同的血管生成因子具有不完全相同的生物學活性，因此，選擇何種血管生長因子至關重要。肝細胞生長因子（hepatocytegrowthfactor,HGF）由間質細胞產生，具有很強的促血管內皮細胞(vascularendothelialcells,VECs)增殖和促血管生成作用，并可抑制細胞凋亡和減輕組織纖維化，已在治療缺血性心臟病和肢體動脈閉塞等疾病中展現出良好的應用前景，有望成為治療ANFH理想的血管生長因

4、子。
　　 骨髓基質干細胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）是一種由骨髓中分離獲得的具有多種分化潛能的間質干細胞，是體內參與組織再生和修復的重要干細胞成分之一，取材方便，易于被外源基因轉染，同時還能分泌大量的促細胞和血管生長因子，其成分中含有骨祖細胞，具有良好的向成骨細胞分化的潛能。此外，BMSCs不具免疫原性，因此同種異體移植無免疫排斥反應，被認為是骨組織工程近階段最有希望應用于臨床的

5、種子細胞。目前，用BMSCs治療早期ANFH已顯示出誘人的應用前景。
　　 將基因治療和干細胞移植治療相結合，用HGF基因修飾BMSCs治療ANFH，比單用BMSCs具有明顯的優(yōu)勢，表現在:(1)BMSCs在發(fā)揮其成骨能力的同時分泌HGF，誘導新血管生成，改善股骨頭血供;(2)HGF對BMSCs有趨化作用，局部高分泌的HGF可使BMSCs“停留”在壞死區(qū)局部，利于其向成骨細胞分化;(3)HGF能抑制BMSCs凋亡，其誘生的血管可

6、改善移植細胞的生存環(huán)境，提高BMSCs移植存活率，進而提高治療效果。
　　 本課題將基因治療、干細胞移植、組織工程技術有機結合，以HGF為目的基因、以BMSCs為靶細胞，借助AdMax腺病毒載體系統，將HGF基因轉入BMSCs;再以其為種子細胞，經髓芯減壓隧道移植到股骨頭壞死區(qū)，用于治療早期ANFH。在減壓的同時，移植細胞分泌的HGF誘導局部新血管生成和側枝循環(huán)建立，改善股骨頭血供;BMSCs在局部微環(huán)境誘導下向成骨細胞分化，修

7、復壞死區(qū)骨質，這種集減壓、血管生成和骨質重建一體化的治療技術，為ANFH治療提供了一種全新的模式。
　　 目的：
　　 在體外探討HGF調節(jié)BMSCs增殖與成骨分化活性的方式與機制的基礎上，評價HGF基因修飾BMSCs治療早期激素性和創(chuàng)傷性ANFH的療效，并初步探討發(fā)病與治療的分子機理。
　　 方法：
　　 1、分離培養(yǎng)與鑒定兔BMSCs
　　 取4-8周齡健康新西蘭大白兔，麻醉后，于雙側髂后上棘

8、行穿刺法抽吸骨髓，抗凝處理后低速離心去上清，以10％FBS-低糖DMEM培養(yǎng)液重懸培養(yǎng)，3d時換液去除未貼壁細胞，其后每3d換液1次;待細胞匯合成單層后消化，傳代細胞培養(yǎng)至第二代備用。
　　 采用誘導培養(yǎng)基體外誘導BMSCs向成骨細胞、成軟骨、脂肪細胞分化。培養(yǎng)12和24天后，磷酸苯二鈉基質(NBT-BCIP)法染色和茜素紅(AR-S)染色以檢測成骨分化水平;培養(yǎng)27天后，阿利新藍染色以檢測成軟骨分化水平，油紅O染色以檢測成脂分

9、化水平;同時以qPCR法檢測BMSCs標志基因Vimentin、成骨細胞標志基因Runx2、成軟骨細胞標志基因SOX9與脂肪細胞標志基因PPAR-γ3mRNA的表達水平。
　　 2、體外檢測HGF調節(jié)BMSCs增殖與分化活性的方式與機制
　　 在成骨誘導環(huán)境中，以低濃度(20ng/mL)和高濃度(100ng/mL)的HGF處理BMSCs，EdU摻入法檢測細胞增殖，WST-8法檢測細胞活性;NBT-BCIP法行堿性磷酸酶(

10、Alkalinephosphatase，ALP)染色，AR-S法檢測鈣結節(jié)的形成。Western和qPCR檢測HGF受體c-Met、細胞分化開關分子——細胞周期抑制分子p27和成骨分化相關轉錄因子Runx2與Osterix的表達;以ERK信號通路特異性抑制劑PD98059(30μM)或Akt信號通路特異性抑制劑Wortmannin(100nM)預處理兔BMSCs1h，Western檢測信號通路活化水平及其對BMSCs增殖與分化的影響。<

11、br>　　 3、重組腺病毒Ad-HGF轉染兔BMSCs，檢測HGF的表達和活性
　　 重組腺病毒Ad-HGF在293細胞中擴增、氯化銫法超離純化，TCID50法測定感染性滴度，然后感染BMSCs，RT-PCR、原位雜交、免疫組化檢測轉染后細胞中HGF的轉錄和表達。
　　 4、兔早期激素性ANFH造模與檢測
　　 采用馬血清注射造成兔過敏性血管炎，再應用大劑量腎上腺糖皮質激素（醋酸潑尼松龍），誘導兔激素性ANFH

12、。4周后利用DR、CT、MRI、動脈墨汁灌注造影、病理切片HE染色、免疫組化等多種方法，觀察ANFH的影像及病理變化。
　　 5、HGF基因修飾BMSCs治療兔早期激素性ANFH的研究
　　 在CT引導下行髓芯減壓術，將HGF基因修飾BMSCs經減壓隧道移植入兔早期激素性ANFH模型壞死區(qū)。治療后4周，利用DR、CT、MRI、動脈墨汁灌注造影、病理切片HE染色、免疫組化等多種檢測手段評價療效，同時設置髓芯減壓組為對照。<

13、br>　　 為探討其機理，以腺病毒空載體轉染BMSCs和未轉染BMSCs為對照，術后4周，病理切片HE染色評價療效;術后2天、2周、4周取材，qPCR檢測p27、Runx2與OsterixmRNA的表達，免疫組化檢測HGF、p-ERK1/2、p-Akt的表達。
　　 6、兔早期創(chuàng)傷性ANFH造模與檢測
　　 采用截斷股骨頸的方法造模:逐層切開表皮與肌肉，打開關節(jié)囊，切斷股骨頭周圍、含圓韌帶在內的血管與韌帶，截斷股骨頸基

14、底部，使股骨頭斷端分離3-5min后復位，逐層縫合。術后3天、1周、2周、3周，利用CT、MRI、病理切片HE染色、免疫組化等多種方法，觀察ANFH的影像及病理變化。
　　 7、HGF基因修飾BMSCs治療兔早期創(chuàng)傷性ANFH的研究
　　 創(chuàng)傷后1周，在CT引導下行髓芯減壓術，將HGF基因修飾BMSCs經減壓隧道移植入兔早期創(chuàng)傷性ANFH模型壞死區(qū)，然后用小夾板固定截斷股骨頸。術后4周，利用病理切片HE染色、免疫組化等手

15、段評價療效，同時設置腺病毒空載體轉染BMSCs和未轉染BMSCs為對照。
　　 為探討其機理，術后2天、2周、4周取材，免疫組化檢測HGF、p-ERK1/2、p-Akt的表達。
　　 8、統計學分析
　　 所有計量資料結果用(x)±s表示。EdU法檢測信號通路抑制劑處理后BMSCs增殖、WST-8法檢測BMSCs活性、NBT-BCIP法檢測ALP活性、AR-S染色法檢測信號通路抑制劑處理后BMSCs鈣結節(jié)形成、q

16、PCR檢測成骨誘導環(huán)境中不同劑量HGF對c-Met、Osterix、Runx2與p27mRNA表達水平的長期影響、IHC檢測體內HGF、p-ERK1/2與p-Akt表達水平采用析因設計資料的方差分析;EdU法檢測未施信號通路抑制劑處理的BMSCs增殖、AR-S染色法檢測鈣結節(jié)形成、骨髓細胞與股骨頭骨髓的面積比、空骨陷窩率、IHC檢測體內vWF、CD105、PCNA、ColⅠ、OCN與VEGF的表達應用單因素方差分析(One-WayANO

17、VA)，方差不齊時用Welch校正，在差異顯著的前提下進行多重比較，方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett'sT3法。檢驗水準α=0.05，雙側檢驗。采用SPSS16.0forwindows統計軟件包進行數據分析。
　　 結果：
　　 1、成功培養(yǎng)出具有多向分化潛能的兔BMSCs
　　 骨髓穿刺法分離、貼壁法純化成功培養(yǎng)出兔BMSCs，染色法與qPCR檢測證實兔BMSCs具有多向分化潛能，可分化為成骨

18、細胞、成軟骨細胞與成脂細胞。
　　 2、體外探討HGF調節(jié)BMSCs增殖與分化活性的方式與機制
　　 ①HGF體外調節(jié)BMSCs增殖與分化的活性
　　 EdU摻入法與WST-8法檢測細胞增殖活性，NBT-BCIP法與AR-S法檢測細胞成骨分化。結果表明，100ng/mLHGF在成骨誘導環(huán)境中促進BMSCs增殖而抑制其向成骨細胞分化，而20ng/mLHGF對BMSCs增殖有所抑制，但顯著促進其向成骨細胞分化。

19、>　　 ②機制研究1:不同劑量HGF對其受體c-Met的表達調控
　　 20ng/mLHGF顯著提高c-Met的表達與活化水平，而100ng/mLHGF則部分抑制c-Met的表達，且對c-Met的活化效應明顯低于20ng/mLHGF。提示不同劑量HGF通過誘導其受體的不同表達與活化水平而產生不同的效應。
　　 ③機制研究2:不同劑量HGF對ERK與Akt信號通路活化水平的影響
　　 100ng/mLHGF通過活

20、化ERK通路、抑制Akt通路活化以顯著促進BMSCs的增殖而抑制其成骨分化;20ng/mLHGF則抑制ERK通路、活化Akt通路，從而顯著促進BMSCs的成骨分化，但對細胞增殖的促進效應低于100ng/mLHGF的作用效果。提示不同劑量HGF通過活化不同信號通路而產生不同效應。
　　 ④機制研究3:不同劑量HGF對分化相關轉錄因子的表達調控
　　 在成骨誘導環(huán)境中，20ng/mLHGF顯著促進BMSCs中p27的表達，并

21、通過提高Osterix與Runx2的表達以促進BMSCs的成骨分化;而100ng/mLHGF對p27的表達具有抑制效應，成骨分化相關轉錄因子的表達也受到抑制。提示不同劑量HGF通過調控p27、Osterix與Runx2的表達而產生不同的效應。
　　 3、Ad-HGF轉染的BMSCs表達高水平HGF
　　 Ad-HGF感染性滴度為2.6×1010TCID50/mL。轉染后的BMSCs在mRNA和蛋白水平均有HGF表達。

22、r>　　 4、成功建立兔早期激素性ANFH模型
　　 DR、CT、MRI、動脈墨汁灌注造影、病理切片HE染色檢測結果表明，激素注射后4周，成功制備出兔早期激素性ANFH模型。免疫組化檢測新生血管指標-CD105和組織修復指標-Ⅰ型膠原(ColⅠ)，結果提示:激素造模后，股骨頭血管生成受抑，成骨反應逐漸減弱，無自身修復現象，4周發(fā)展為早期激素性ANFH。
　　 5、HGF基因修飾BMSCs治療兔早期激素性ANFH的研究<

23、br>　　 ①療效評價:
　　 影像學和病理組織學檢查結果表明，治療組可顯著促進壞死區(qū)血管再生和骨質重建，DR顯示治療側股骨頭骨紋理較清楚;CT示點狀低密度影數量減少;MRI示點線狀高信號影不明顯;動脈墨汁灌注造影顯示軟骨下血管重建，干骺端大血管恢復;病理切片HE染色結果顯示骨小梁排列基本規(guī)則，骨基質量增多，空骨陷窩少，骨小梁骨板上可見新生毛細血管，邊緣有大量成骨細胞，骨髓中造血組織基本恢復。
　　 ⑦體內實驗機理研究

24、:
　　 HGF基因修飾BMSCs治療組p27、Runx2與Osterix的表達水平最高，表達高峰在移植后2周。HGF的表達水平在ANFH模型組中顯著降低，但在HGF基因修飾BMSCs治療組中達到最高峰，表達高峰出現在移植后2天，ERK1/2信號通路活化水平隨之增加，之后二者表達水平逐漸降低。2周后p-Akt的水平逐漸增高，表達峰值出現在移植后4周。上述結果表明，HGF基因修飾BMSCs的HGF表達水平具有與體外相同的變化趨勢，

25、并通過與體外相同的機制，即由腺病毒載體介導的HGF體內濃度的有序改變來調控BMSCs增殖與分化，發(fā)揮促組織修復與再生的功能。
　　 6、成功建立兔早期創(chuàng)傷性ANFH模型
　　 影像學與病理組織學檢查結果表明，術后3周，成功制備出處于臨床ARCOⅠ-Ⅱ期的兔早期創(chuàng)傷性ANFH模型。病理組織學檢查可見骨組織與血管系統發(fā)生明顯的壞死病變，同時，創(chuàng)傷后2周內可見明顯的組織自我修復。CD105、ColI、OCN和PCNA免疫組化檢

26、測結果顯示，手術截斷股骨頸后，股骨頭血管生成受抑，組織損傷顯著，術后3天有一定程度的自身修復，之后由于血運阻斷，修復失敗，3周發(fā)展為早期創(chuàng)傷性ANFH。
　　 7、HGF基因修飾BMSCs治療兔早期創(chuàng)傷性ANFH的研究
　　 病理組織學檢查結果表明，HGF基因修飾BMSCs可顯著促進創(chuàng)傷組織的恢復，免疫組化檢測到ColI的表達模式與未治療組相反，提示成骨細胞活性增加，同時在治療組動物中VEGF與CD105表達上調，提示新

27、生血管的發(fā)生，進一步證實了BMSCs的療效。HGF在其中以類似于在激素性ANFH中的機制對BMSCs活性進行調節(jié)，從而促進其修復創(chuàng)傷組織的功能。
　　 結論：
　　 1、獲得高表達人HGF基因的BMSCs，為其用于早期ANFH的治療奠定基礎。
　　 2、成功誘導了兔早期激素性和創(chuàng)傷性ANFH模型，為進一步研究其發(fā)病機理、發(fā)展新的有效的早期治療方法提供了基礎，為將來評估新療法的療效提供了適宜的平臺。