hCGRPα基因修飾BMSCs聯(lián)合自體骨移植治療股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 (1)構(gòu)建人降鈣素基因相關(guān)肽α(hCGRPα)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pLNCX2-hCGRPα),制備重組逆轉(zhuǎn)錄病毒液,進(jìn)行病毒滴度測定。
　　 (2)hCGRPα基因修飾兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),觀察對BMSCs生物活性和成骨活性的影響。
　　 (3)液氮冷凍法制作家兔股骨頭壞死模型,觀察轉(zhuǎn)基因BMSCs聯(lián)合自體骨移植治療股骨頭壞死的效果。
　　 方法:
　　 1.制備重組逆

2、轉(zhuǎn)錄病毒(1)人工合成hCGRPα基因:根據(jù)GenBank中hCGRPα的cDNA編碼序列,在5'端與3'端分別加上HindⅢ和EcoRV內(nèi)切酶位點(diǎn),人工合成得到hCGRPα DNA片段。(2)構(gòu)建病毒載體:用HindⅢ和EcoRV同時(shí)雙酶切pLNCX2和人工合成的hCGRPα DNA片段,純化后用T4連接酶將hCGRPα重組入pLNCX2中,經(jīng)測序分析得到重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX2-hCGRPα。(3)病毒包裝:將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載

3、體pLNCX2-hCGRPβ轉(zhuǎn)染入PT67細(xì)胞進(jìn)行包裝,收集病毒液,離心、過濾,進(jìn)行病毒滴度測定。
　　 2.細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)(1)分離、培養(yǎng)家兔BMSCs:選用4-6周齡家兔,于無菌條件下獲得兔自體骨髓,使用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液梯度離心法進(jìn)行細(xì)胞的分離、培養(yǎng),得到自體原代骨髓干細(xì)胞。(2)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染體外BMSCs:于感染前12-18h,取第2代BMSCs以1.5×105/的孔密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將細(xì)胞隨機(jī)分為3

4、組:①正常對照組:BMSCs正常培養(yǎng),不給予特殊處理。②實(shí)驗(yàn)組:經(jīng)pLNCX2-hCGRPα感染的BMSCs組。③空載體組:pLdNCX2感染組。(3)將細(xì)胞培養(yǎng)至第三代,RT-PCR檢測細(xì)胞hCGRPα-mRNA的表達(dá);Western-blot檢測細(xì)胞hCGRPα蛋白的表達(dá)。(4)MTT法檢測細(xì)胞增殖活性;堿性磷酸酶(ALP)活性測定;膠原(Collagen)含量測定;骨鈣素(BGP)含量測定;層粘連蛋白(LN)測定。
　　

5、3.動物實(shí)驗(yàn):(1)分組實(shí)驗(yàn):取健康新西蘭種家兔74只,2～3月齡,體重2.7±0.5kg/只,雌雄不拘。應(yīng)用液氮冷凍法隨機(jī)制作家兔單側(cè)股骨頭壞死。造模8周后,隨機(jī)選取2只處死,行組織形態(tài)學(xué)檢查。其余72只隨機(jī)分為3組,每組實(shí)驗(yàn)動物24只。①A組:轉(zhuǎn)基因BMSCs聯(lián)合自體支撐骨移植。手術(shù)暴露股骨頭,于股骨轉(zhuǎn)子部鑿取一皮質(zhì)骨小骨柱,長約4mm、寬約2mm。另向深部挖取數(shù)團(tuán)松質(zhì)骨小顆粒,術(shù)中備用。在頸后部股骨頭軟骨緣下方開一小骨窗,挖除股骨

6、頭內(nèi)部壞死骨。將術(shù)前備用的兔轉(zhuǎn)基因BMSCs(含有pLNCX2-hCGRPα質(zhì)粒)與松質(zhì)骨小顆粒混合,植于股骨頭軟骨下方及頭內(nèi)四周。隨后于股骨頭內(nèi)中央位置支撐植入皮質(zhì)骨骨柱,上端與軟骨內(nèi)面頂緊,遠(yuǎn)端卡牢。②B組:正常BMSCs聯(lián)合自體支撐骨移植。手術(shù)方式同A組,植入干細(xì)胞為正常BMSCs(不含pLNCX2-hCGRPα質(zhì)粒)。③C組:單純自體支撐骨移植。手術(shù)方式同A組,植入骨不與干細(xì)胞混合。(2)觀察治療效果:于植骨手術(shù)后第3、6月末處

7、死動物,生物力學(xué)與組織形態(tài)學(xué)HE染色觀察治療效果。
　　 結(jié)果:
　　 (1)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX2-hCGRPα菌液的測序結(jié)果與GenBank公布的DNA序列一致。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX2-hCGRPα經(jīng)過包裝細(xì)胞PT67的包裝,其產(chǎn)生的病毒上清液感染NIH3T3細(xì)胞,獲得穩(wěn)定表達(dá)后,計(jì)算病毒滴度為1.7×106pfu/mL,具有較高的感染效率。
　　 (2)將hCGRPa基因轉(zhuǎn)染BMSCs,RT

8、-PCR檢測轉(zhuǎn)基因BMSCs可表達(dá)hCGRPα基因;Western blotting分析可表達(dá)hCGRPα蛋白。
　　 (3)表達(dá)hCGRPα基因的BMSCs(BMSCs/pLNCX2-hCGRPα細(xì)胞)與正常培養(yǎng)的BMSCs和只轉(zhuǎn)染空載體的千細(xì)胞(BMSCs/pLNCX2細(xì)胞)相比,表現(xiàn)出較高的增殖率(P＜0.05)。BMSCs/pLNCX2-hCGRPα細(xì)胞與BMSCs/pLNCX2細(xì)胞和正常BMSCs相比,其ALP、Col

9、lagen、LN、BGP的含量明顯高于兩對照組細(xì)胞,具有顯著性差異(P＜0.05)。而BMSCs和BMSCs/pLNCX2細(xì)胞相比,其ALP、Collagen、LN、BGP的含量無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 (4)于液氮冷凍法造模8周,組織學(xué)觀測見動物模型側(cè)股骨頭組織內(nèi)出現(xiàn)大量空骨陷窩,并且骨小梁變細(xì)、組織稀疏,排列紊亂。部分骨小梁斷裂,骨髓腔內(nèi)造血組織減少,骨細(xì)胞出現(xiàn)變性死亡,為典型的股骨頭壞死表現(xiàn)。治療術(shù)后3月:A組

10、中新生骨小梁排列基本規(guī)則,骨小梁為成熟的骨小梁,并有大量的骨細(xì)胞形成;B組標(biāo)本中骨小梁排列不規(guī)則,觀察到骨小梁大部分為幼稚的骨小梁,可見骨細(xì)胞生成;C組標(biāo)本骨小梁變細(xì)、稀疏、部分?jǐn)嗔?骨髓腔內(nèi)充滿壞死組織碎片,骨細(xì)胞變性死亡,造血組織壞死,大量空骨陷窩出現(xiàn)。移植骨治療術(shù)后3個(gè)月,測得A組手術(shù)側(cè)股骨頭軟骨下骨、松質(zhì)骨的平均彈性模量和最大壓縮強(qiáng)度均高于B組、C組(p＜0.05),而與正常側(cè)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。移植骨治療術(shù)后

11、6個(gè)月A組手術(shù)側(cè)股骨頭軟骨下骨、松質(zhì)骨的平均彈性模量和最大壓縮強(qiáng)度與正常側(cè)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05),而C組手術(shù)側(cè)股骨頭已塌陷。
　　 結(jié)論:
　　 (1)利用基因工程技術(shù)可成功構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX2-hCGRPα,經(jīng)包裝后的病毒液具有較高的感染效率。
　　 (2)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的方法可將hCGRPα基因轉(zhuǎn)染至兔BMSCs中,轉(zhuǎn)基因BMSCs可表達(dá)hCGRPα基因并檢測到hCGRPα蛋白