人肝細胞癌中DEK基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究.pdf

1、目的:DEK蛋白在多種人類侵襲性腫瘤中均出現(xiàn)過表達，目前已被確認為是一種癌基因，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。前期研究結(jié)果顯示，DEK基因在人肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的表達量明顯高于正常肝細胞，提示DEK可能在HCC的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用;同時，DEK基因核心啟動子序列(-167bp～+35bp)的甲基化水平在HCC細胞系和正常肝細胞中存在顯著差異，且在HCC細胞系中普遍處于低甲基化狀態(tài)。

2、鑒于目前對DEK基因的轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控機制研究還比較少，因此本研究在前期工作基礎(chǔ)上，進一步對DEK基因核心啟動子序列進行分析和后續(xù)研究，以確定調(diào)控該基因轉(zhuǎn)錄表達的重要轉(zhuǎn)錄因子，從而揭示DEK基因在人肝細胞癌中過表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。
　　方法:基于前期的工作基礎(chǔ)，本研究運用在線軟件TFSEARCH對DEK啟動子CpG島區(qū)域可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點進行預(yù)測，結(jié)合DNA甲基化差異分析，初步篩選出對DEK基因核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性起重要調(diào)

3、控作用的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點。之后，對預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行定點突變和缺失突變來驗證該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點是維持DEK基因啟動子活性的重要調(diào)控區(qū)。最后，利用siRNA干擾、轉(zhuǎn)錄因子過表達實驗和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù)驗證預(yù)測的重要轉(zhuǎn)錄因子對DEK基因啟動子活性及其轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控作用以及與DEK啟動子在HCC細胞系中的相互作用。
　　結(jié)果:雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，DEK截短啟動子序列中緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點的CpG2-2片段對D

4、EK啟動子活性影響最大。進一步，TFSEARCH預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CpG2-2區(qū)域存在AP-2α等轉(zhuǎn)錄因子的特異結(jié)合位點，結(jié)合正常細胞與組織以及HCC細胞系中甲基化位點差異分析發(fā)現(xiàn)AP-2α結(jié)合位點的甲基化差異最大，因此我們預(yù)測AP-2α是調(diào)控DEK啟動子轉(zhuǎn)錄活性的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。之后，定點突變和缺失突變實驗結(jié)果表明，AP-2α轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點可明顯調(diào)控DEK核心啟動子的轉(zhuǎn)錄活性;進一步的siRNA干擾、轉(zhuǎn)錄因子過表達實驗和染色質(zhì)免疫沉淀