發(fā)揮抗乙肝病毒作用初步研究.pdf

1、第一部分，目的：初步探討蛇葡萄根Ampelopsis sinica W．T．Wang 體外抗乙肝病毒效果。
　　 方法：以HBV全基因組轉(zhuǎn)染的人肝癌細胞系HepG2 2.2.15作為抗病毒細胞模型，首先采用細胞病變效應(yīng)檢測法以及MTT 法檢測蛇葡萄根對該細胞的毒性作用，然后加入不同無毒濃度蛇葡萄根對細胞進行不同時間的干預(yù)。ELISA 法和實時熒光定量PCR 法分別檢測上清液中HBsAg、HBeAg的分泌量和HBV DNA 含量。

2、
　　 結(jié)果：200μg/ml及200μg/ml 以下濃度蛇葡萄根對HepG2 2.2.15的活性沒有顯著影響（P＞0.05）。在無毒濃度范圍內(nèi)，不同濃度蛇葡萄根干預(yù)細胞后細胞所分泌的HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平較未干預(yù)組低（P＜0.05），且藥物濃度越高，對HBsAg、HBeAg和HBV DNA的分泌抑制作用越明顯，呈濃度依賴性。但與作用時間沒有明顯依賴關(guān)系。
　　 結(jié)論：蛇葡萄根通過抑制HBsAg、HB

3、eAg和HBV DNA的分泌而初步顯示其抗病毒效果。為臨床抗病毒藥物的研究提供了一定的理論依據(jù)。
　　 第二部分，目的：為了明確蛇葡萄根抗病毒的作用機制。
　　 方法：首先對蛇葡萄根抗乙肝病毒過程中的信號通路進行篩選，以帶有熒光素酶報告基因的PathDetect Cis-/Trans-Reporting Systems （pNFκB-Luc，pAP-1-Luc， pISRE-Luc， p53-Luc， pFA2-Elk1

4、， pFA2-cJun， pFA2-CHOP，pFA2-CREB，pFR-Luc）轉(zhuǎn)染HepG2細胞，蛇葡萄根干預(yù)后，檢測熒光素酶活性，并用流式細胞儀檢測蛇葡萄根干預(yù)HepG2 2.2.15細胞48h后，細胞凋亡情況；然后從HBV 轉(zhuǎn)錄水平來闡明問題，我們構(gòu)建了五種帶有熒光素酶報告基因的HBV 啟動子質(zhì)粒（Cp, Xp, S1p, S2p和Fp）以及五個啟動子截短報告質(zhì)粒，并分別轉(zhuǎn)入人肝癌細胞系HepG2，蛇葡萄根干預(yù)后檢測熒光素酶活性

5、。
　　 結(jié)果：蛇葡萄根能夠抑制p53的活性（P＜0.05），對HepG2 2.2.15細胞具有促凋亡作用；蛇葡萄根能選擇性抑制HepG2細胞中HBV 啟動子活性（Cp，S1p和Fp）（P＜0.05）以及截短質(zhì)粒t1，t4和t5的活性（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：蛇葡萄根的抗病毒作用可能與其抑制HBV 轉(zhuǎn)錄及p53通路有關(guān)，并且可能是通過抑制p53通路誘導(dǎo)細胞凋亡從而抑制病毒復(fù)制。
　　 第三部分，目的：為了促

6、進蛇葡萄根的深入開發(fā)和為臨床進程提供科學(xué)依據(jù)。對該藥用植物的各種提取制備工藝做一簡述及比較。
　　 方法：采用水煮法、回流法、滲漉法等5 項提取工藝分別提取蛇葡萄根，測定提取液所含的小分子水溶性指標性成分沒食子酸和提取物的干浸膏量。
　　 結(jié)果：以本實驗推薦的5＃工藝方法提取的提取物，其雜質(zhì)減少了約70％，但提取液中小分子水溶性指標性成分沒食子酸的含量沒有明顯差異。
　　 結(jié)論：用該工藝最終制備的蛇葡萄根提取液或