鮮蒲公英抗乙肝病毒物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、蒲公英系菊科多年生草本植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.Mazz.、堿地蒲公英TaraxacumsinicumKitag.。全國各地均有分布，野生資源十分豐富，具有開發(fā)利用潛質(zhì)。其鮮品能最大限度的保留藥材中全部藥用成分和營養(yǎng)成分，不受提取加工過程的破壞。其具有清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋的功效。富含多糖、酚酸、黃酮等多種化學(xué)成分，具有明顯的抗炎和抗病毒作用。目前很多研究都是針對蒲公英干藥材進(jìn)行的，很少有涉及鮮蒲公

2、英抗病毒方面的研究。本課題從鮮、干蒲公英抗乙肝病毒藥效物質(zhì)基礎(chǔ)差異出發(fā)，在中藥“組分結(jié)構(gòu)”理論的指導(dǎo)下，以HepG2.2.15細(xì)胞為體外藥效模型，篩選鮮蒲公英體外抗乙肝病毒的活性部位;采用現(xiàn)代分離純化技術(shù)，對鮮蒲公英中有效組分及成分進(jìn)行分析，并結(jié)合體外藥效試驗(yàn)，進(jìn)一步解析鮮蒲公英抗乙肝病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 本文首先對中藥鮮藥國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，及鮮、干藥材在有效成分和整體藥理活性等物質(zhì)基礎(chǔ)方面的差異進(jìn)行了概述;比較了目前用于抗乙型

3、肝炎病毒藥物活性篩選的體內(nèi)外模型，總結(jié)了中藥抗乙肝病毒的研究概況，并通過查閱文獻(xiàn)，總結(jié)了蒲公英化學(xué)成分與抗病毒的相關(guān)性，最后在“組分結(jié)構(gòu)”理論的基礎(chǔ)上提出了鮮蒲公英抗乙肝病毒物質(zhì)基礎(chǔ)的研究思路和方法。在此基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)部分主要進(jìn)行了以下研究:
　　 1、蒲公英鮮、干藥材抗乙肝病毒藥效比較及其主要化學(xué)成分差異研究
　　 (1)鮮、干藥材的處理方法。對蒲公英鮮藥材的提取采用榨汁處理的方法。對蒲公英干藥材的處理，以提取得率為依據(jù)

4、，在提取工藝上比較了超聲和回流提取;在提取溶劑上，通過比較5％甲酸的50％甲醇提取和蒸餾水超聲提取，最終確定采用5％甲酸的50％甲醇超聲提取。
　　 (2)比較了鮮、干蒲公英體外抗乙肝病毒藥效差異。以HepG2.2.15細(xì)胞為乙肝病毒體外細(xì)胞模型，測定了藥物對HepG2.2.15細(xì)胞的毒性及HBsAg、HBeAg和HBVDNA三個(gè)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鮮、干蒲公英藥材的濃度小于等于60μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率＞95％。不同濃度的鮮

5、、干蒲公英藥材對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg和HBVDNA的表達(dá)均有抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依耐性，鮮蒲公英對HBsAg、HBeAg和HBVDNA抑制作用優(yōu)于干藥材。
　　 (3)鮮、干藥材主要化學(xué)成分差異的比較研究:UPLC分析結(jié)果表明，鮮、干蒲公英中主要化學(xué)成分在含量上有明顯差異，結(jié)合前面的藥效結(jié)果，鮮、干蒲公英抗乙肝病毒的活性差異可能與鮮、干藥材中的化學(xué)成分含量變化有關(guān)。這主要是由于鮮藥在干制等加工處理過

6、程中，破壞了鮮藥中原有的一些活性成分，使藥材中的化學(xué)成分含量發(fā)生了變化，最終導(dǎo)致藥材內(nèi)部的組分結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。
　　 2、鮮蒲公英榨汁液不同溶劑部位的分離富集及藥效研究
　　 (1)結(jié)合鮮、干蒲公英主要成分差異和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，以蒲公英中總酚酸、總黃酮的含量為考察指標(biāo)，對7種不同極性的大孔樹脂進(jìn)行篩選，考察相關(guān)工藝參數(shù)，最終確定AB-8型大孔樹脂效果最佳。
　　 (2)采用AB-8型大孔樹脂，對鮮蒲公英榨汁液進(jìn)行富

7、集純化，用蒸餾水及不同梯度的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明AB-8水洗部位主要富集的為多糖、蛋白等大分子物質(zhì)，10％、30％、50％乙醇洗脫部位主要富集了蒲公英中的小分子物質(zhì)，70％、95％乙醇洗脫部位沒有固形物。
　　 (3)結(jié)合HepG2.2.15細(xì)胞體外模型，對不同溶劑部位進(jìn)行藥效評價(jià)，結(jié)果表明，鮮蒲公英榨汁液水洗部位、10％、30％、50％乙醇洗脫部位在濃度不大于60μg/ml時(shí)，對細(xì)胞沒有毒性作用?？乖虷BVDNA抑制實(shí)

8、驗(yàn)表明，鮮蒲公英榨汁液水洗部位、30％、50％乙醇洗脫部位能夠顯著抑制HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg，及HBVDNA的表達(dá)水平，且呈現(xiàn)濃度依賴性。而10％乙醇洗脫部位對抗原分泌和HBVDNA的表達(dá)抑制作用不明顯。
　　 3、鮮蒲公英抗乙肝病有效組分內(nèi)部結(jié)構(gòu)解析及其配伍體外藥效研究
　　 (1)經(jīng)分析，AB-8大孔樹脂水洗部位主要為鮮蒲公英多糖組分，30％乙醇洗脫部位主要為鮮蒲公英酚酸組分，50％乙醇洗

9、脫部位主要為鮮蒲公英黃酮組分，經(jīng)含量測定，總多糖、總酚酸、總黃酮的含量比為:14.68∶13.65∶11.56。
　　 (2)經(jīng)過UPLC分析，鮮蒲公英酚酸組分中主要活性成分有綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸C，含量比為:6.37∶10.35∶4.80∶1;鮮蒲公英黃酮組分中主要活性成分有木犀草苷、槲皮素、木犀草素，含量比為:1∶1.77∶1.46。
　　 (3)對鮮蒲公英不同組分及其配伍后的組合物進(jìn)行了抗乙肝病毒的

10、藥效評價(jià)。體外藥效結(jié)果表明，鮮蒲公英多糖組分、酚酸組分、黃酮組分及其配伍后的組合物在濃度不大于60μg/ml時(shí)，對細(xì)胞沒有毒性作用。對抗原和HBVDNA抑制實(shí)驗(yàn)表明，鮮蒲公英多糖組分、酚酸組分、黃酮組分及其配伍后的組合物能夠顯著抑制HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg，及HBVDNA的表達(dá)水平，且呈現(xiàn)濃度依賴性。多糖組分、酚酸組分和黃酮組分配伍的組合物體外抗乙肝病毒的效果優(yōu)于配伍前的單個(gè)組分，但其與鮮蒲公英榨汁液整體相比較

11、，抗乙肝病毒作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05）。
　　 4、蒲公英抗乙肝病毒作用機(jī)制的研究
　　 本文對鮮蒲公英抗乙肝病毒的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，研究表明蒲公英可能是通過激活NF-KB信號通路，上調(diào)IL-2、INF-y和MxA等因子的表達(dá)來抑制HBVDNA的復(fù)制，從而達(dá)到抗乙肝病毒的功效。
　　 5.工作總結(jié)和展望
　　 對本文所做的工作進(jìn)行了總結(jié)，提出了課題的研究創(chuàng)新點(diǎn)，針對課題研究中存在的一些不足提出了相