HBV感染與膽紅素、鐵調(diào)素的關(guān)聯(lián)分析及鐵調(diào)素的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的：
　　探討HBV感染及肝損傷程度與具有潛在抗氧化活性同時(shí)也是肝損傷標(biāo)志物的膽紅素和鐵代謝核心調(diào)控分子鐵調(diào)素（hepcidin）的關(guān)聯(lián)性，并從氧化應(yīng)激角度揭示HBV感染影響hepcidin表達(dá)的相關(guān)機(jī)制與信號(hào)通路。
　　方法：
　　1.基于東風(fēng)-同濟(jì)隊(duì)列研究2013年隨訪的橫斷面資料，納入28,500名研究對象，在比較HBsAg攜帶者與非攜帶人群膽紅素水平差異的基礎(chǔ)上，采用Logistics回歸分析方法，分析HBs

2、Ag攜帶者不同類型膽紅素與反映肝損傷程度的非侵入性指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性。
　　2.選取在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科就診的192名研究對象（不同程度的慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）患者172例，對照組20例），在應(yīng)用多因素Logistics回歸分析CHB患者與鐵代謝紊亂程度相關(guān)性的基礎(chǔ)上，探討其與hepcidin的關(guān)系，探尋更為敏感和特異的預(yù)測預(yù)警CHB肝損傷程度指標(biāo)。
　　3.基于前

3、一部分研究結(jié)果，采用兩段式線性回歸模型繼續(xù)探討CHB患者氧化應(yīng)激水平和hepcidin水平之間的關(guān)聯(lián)性；在此基礎(chǔ)上，以乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）穩(wěn)定復(fù)制的HepG2.2.15細(xì)胞為研究對象，以骨形態(tài)蛋白6（Bone morphogenetic protein6,BMP6）/SMAD家族成員4（Smad family member4,SMAD4）為靶點(diǎn)，應(yīng)用qRT-PCR、western-blot、細(xì)胞免疫

4、熒光等方法檢測hepcidin、BMP6、SMAD4的表達(dá)或轉(zhuǎn)位，分析HBV復(fù)制過程中氧化應(yīng)激介導(dǎo)的hepcidin表達(dá)變化的潛在信號(hào)調(diào)控通路。
　　結(jié)果：
　　1.本部分研究納入28,500名研究對象，兩組的平均年齡為（HBsAg(+)：62.8±7.8vs.HBsAg(-)：64.4±8.5），女性所占百分比為（HBsAg(+)：50.6％vs.HBsAg(-)：56.6%）。和對照組相比較，HBsAg攜帶者膽紅素水平較

5、高（總膽紅素：16.52±7.16vs.14.70±6.07，P<0.001）。
　　2.在HBsAg攜帶者中，膽紅素水平和評(píng)價(jià)肝損傷嚴(yán)重程度指標(biāo)呈正相關(guān)關(guān)系。將總膽紅素水平按照四分位數(shù)分成四層，校正相關(guān)混雜因素后，研究對象總膽紅素高水平組第四層與最低水平組比較，肝損傷指數(shù)升高的風(fēng)險(xiǎn)升高，對應(yīng)的比值比（odds ratios,ORs）和95%置信區(qū)間（95%confidence intervals,95%CIs）是ORs FIB-

6、4（95%CIs）：2.24(95%CIs,1.57-3.21)和ORs APRI（95%CIs）：2.22(95%CIs,1.60-3.08)。
　　3.和間接膽紅素比較，較高水平的直接膽紅素與升高的肝損傷指標(biāo)的比值比更大，而且在女性、超重或向心型脂肪分布的HBsAg攜帶者中更為顯著。
　　4.本部分研究納入192名研究對象（172名CHB患者與20名對照）。CHB患者血漿hepcidin水平比對照組低，并且隨著肝炎嚴(yán)重程

7、度的升高，hepcidin水平逐漸下降。在輕度、中度和重度CHB患者中，血漿hepcidin(ng/mL)水平分別是67.01(41.24，100.53)，38.84(29.61，58.84)和27.54(10.99，47.11)。
　　5.在CHB患者中，單因素分析結(jié)果顯示血漿hepcidin、血清鐵蛋白、血清鐵等指標(biāo)和CHB疾病嚴(yán)重程度之間顯著相關(guān)。降低的hepcidin水平是CHB嚴(yán)重程度升高的危險(xiǎn)因素，對應(yīng)的ORs（95%

8、CIs）是0.494(0.375，0.652)。進(jìn)行多因素Logistics回歸分析后發(fā)現(xiàn)，研究對象hepcidin高水平組第四層與最低水平組比較，發(fā)生CHB嚴(yán)重程度增加的風(fēng)險(xiǎn)降低，對應(yīng)的ORs（95%CIs）是0.215(0.064，0.727)。
　　6.根據(jù)多因素Logistics回歸分析的結(jié)果，本研究計(jì)算了可以輔助評(píng)價(jià)CHB嚴(yán)重程度的組合指數(shù)，H-score，其預(yù)測中重度肝炎和重度肝炎的工作曲線下面積分別是0.823（0.

9、755，0.879)，0.797（0.727，0.857）。
　　7.在CHB患者中，本研究發(fā)現(xiàn)隨著血漿MDA水平的升高，hepcidin呈現(xiàn)下降趨勢。將MDA水平進(jìn)行三分位劃分后，hepcidin濃度分別是41.68（24.82，66.24），48.77（29.74，70.61），26.59（10.94，52.29），P=0.005，呈現(xiàn)下降趨勢，且二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，rho=-0.243，P=0.001。
　　8.進(jìn)一步使

10、用兩段式線性回歸模型分析，本研究發(fā)現(xiàn)，MDA初步升高時(shí)，hepcidin并沒有呈現(xiàn)下降趨勢。但是隨著MDA水平的進(jìn)一步升高，hepcidin呈現(xiàn)明顯的下降趨勢（β（95%CIs）=-2.80（-3.90，-1.70），P<0.001）。
　　9.與對照相比較，H2O2明顯抑制HBV復(fù)制細(xì)胞hepcidin的表達(dá)，而這種抑制作用可以被N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）拮抗；同時(shí)，H2O2處理降低了BM

11、P6的表達(dá)，而且SMAD4在細(xì)胞核的表達(dá)強(qiáng)度有所減弱；經(jīng)過NAC和BMP6的激活劑處理后，SMAD4在細(xì)胞核表達(dá)強(qiáng)度接近正常對照組水平；BMP6抑制劑進(jìn)一步增強(qiáng)H2O2對SMAD4在細(xì)胞核表達(dá)的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　HBsAg攜帶者血清膽紅素水平尤其是直接膽紅素與非侵入性肝損傷指標(biāo)之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。CHB患者循環(huán)hepdidin水平與CHB嚴(yán)重程度顯著負(fù)相關(guān)，而與機(jī)體的氧化應(yīng)激水平呈二段式線性關(guān)系。在此過程中，