麥冬皂苷B通過(guò)miR-34b-5p對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞影響的研究.pdf

1、研究的目的和意義:
　　肺癌嚴(yán)重危害人類健康是目前世界上最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤所致的死亡中居首位，造成極大的疾病負(fù)擔(dān)。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要病理類型，占所有肺癌病例的80％以上。隨著綜合治療模式以及分子生物化學(xué)的發(fā)展，NSCLC的療效有所提高，但預(yù)后仍不理想，5年總生存率不到20％。微小核糖核酸(miRNA)是一類廣泛存在的非編碼蛋白的小分子RNA，m

2、iRNA表達(dá)及調(diào)控失衡在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，隨著對(duì)microRNA研究的深入，越來(lái)越多的研究顯示miRNA在肺癌的發(fā)展過(guò)程中占有重要的地位。其中miR-34b-5p被證實(shí)與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
　　目前中醫(yī)藥在臨床上治療腫瘤已取得顯著療效，相比于西醫(yī)治療腫瘤，中醫(yī)在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和遷移，防止腫瘤復(fù)發(fā)，穩(wěn)定瘤體，改善患者全身癥狀，提高患者生活質(zhì)量等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)?！爸苁峡私饚r方”是國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教

3、授通過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐總結(jié)由養(yǎng)陰益氣、活血祛瘀、燥濕化痰、軟堅(jiān)散結(jié)等四類功效藥物組成的治療肺癌的有效方劑。經(jīng)高通量篩選，得到對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)有細(xì)胞毒作用的單體靶點(diǎn)有20余種，包括麥冬皂苷、異甘草素、槲皮素、人參皂苷和聯(lián)芐類化合物等單體化合物。在這張抗肺癌方劑中，麥冬皂苷B(Ophiopogonin B，OP-B)作為一味不可或缺的中藥組分，具有顯著的體外抗癌作用，但其相關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)感染過(guò)表達(dá)慢病毒LV-h

4、sa-miR-34b的A549細(xì)胞以及加入了OP-B的A549細(xì)胞中miR-34b-5p及Met的表達(dá)，來(lái)揭示OP-B抗NSCLC的可能機(jī)制。
　　方法:
　　通過(guò)閱讀相關(guān)文獻(xiàn)，挑選出數(shù)個(gè)對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞有影響的miRNA，通過(guò)Real-time PCR技術(shù)從中篩選出加入麥冬皂苷B后差異表達(dá)的miRNA，以此miRNA為靶點(diǎn)，通過(guò)Real-time PCR技術(shù)比較其在正常胚胎肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞以及A549細(xì)

5、胞中的表達(dá)量，鑒定其在非小細(xì)胞肺癌A549的表達(dá)特性，判斷其發(fā)揮的作用。構(gòu)建hsa-miR-34b過(guò)表達(dá)慢病毒載體，用重組質(zhì)粒pHLV-miR-34b感染A549細(xì)胞并鑒定轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)常用的TargetScans、PicTar和PITA等靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-34b的潛在靶基因。通過(guò)Real-time PCR以及Western Blot技術(shù)從基因水平以及蛋白水平驗(yàn)證miR-34b-5p和OP-B對(duì)Met的影響，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和tra

6、nswell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-34b-5p對(duì)A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響，以期揭示OP-B可能的抗癌機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.Real-time PCR結(jié)果顯示加入藥物前后miR-21-5p、miR-148a-3p、miR-29a-3p、miR-338-5p、miR-125a-5p的表達(dá)變化不明顯，而miR-34b-5p的表達(dá)變化顯著，明顯升高，說(shuō)明麥冬皂苷B能影響A549細(xì)胞中miR-34b-5p的表達(dá)。
　　2.R

7、eal-time PCR顯示正常胚胎肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞中miR-34b-5p的表達(dá)量明顯高于非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，說(shuō)明miR-34b-5p在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮抑癌的作用。
　　3.hsa-miR-34b過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及效率鑒定的實(shí)驗(yàn)，通過(guò)基因測(cè)序顯示miR-34b的基因正確地插入到了載體pHLV中，Real-time PCR顯示轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞miR-34b-5p的表達(dá)量明顯升高，熒光鏡下可見發(fā)光蛋白，說(shuō)明重組慢病

8、毒質(zhì)粒成功感染A549細(xì)胞。
　　4.通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)并利用生物學(xué)靶基因預(yù)測(cè)軟件分析，發(fā)現(xiàn)miR-34b預(yù)測(cè)的靶基因中包括met，且提示met可能是miR-34b-5p的關(guān)鍵下游靶基因。
　　5.Real-time PCR以及Westem Blot結(jié)果示Micro-up組和OP-B組細(xì)胞Met的表達(dá)低，而A549組和NC組Met的表達(dá)高。
　　6.劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Micro-up組細(xì)胞遷移和侵襲

9、慢，而NC組細(xì)胞遷移和侵襲快。
　　結(jié)論:
　　1.麥冬皂苷B能顯著降低非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中miR-34b-5p的表達(dá)水平。
　　2.miR-34b-5p在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抗癌作用。
　　3.met是miR-34b-5p的靶標(biāo)基因。
　　4.外源性上調(diào)miR-34b-5p的表達(dá)，可在基因和蛋白水平下調(diào)Met的表達(dá);加入麥冬皂苷B，也可在基因和蛋白水平下調(diào)Met的表達(dá)。麥冬皂苷B