紫草素對肺癌A549細胞增殖、凋亡影響的機制研究.pdf

1、肺癌死亡率在世界范圍內(nèi)居惡性腫瘤的首位，5年生存率僅為7％。NSCLC占肺癌的75％-80％左右，化療在其治療中仍發(fā)揮重要作用。抗癌藥物主要通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡來發(fā)揮其治療作用，傳統(tǒng)化療藥因非選擇性殺傷作用和毒副反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用。近年來，中草藥作為抗腫瘤藥及新的化療佐劑已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。
　　紫草素(shikonin)是從傳統(tǒng)中藥紫草中分離出的主要活性成分，屬萘醌類化合物，具有多種生物學(xué)活性，主要具有抗炎及抗腫瘤等作用。近

2、年來的研究發(fā)現(xiàn)，紫草素能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡，但其誘導(dǎo)凋亡的確切機制仍不清楚。
　　p53為抑癌基因，它通過引起細胞周期阻滯和細胞凋亡來維持基因組的穩(wěn)定性，在防止腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著非常重要的角色。研究表明，p53參與了紫草素誘導(dǎo)的Hela細胞、結(jié)腸癌細胞及黑色素瘤細胞凋亡，p53是否參與了紫草素誘導(dǎo)的A549細胞凋亡尚不清楚。
　　磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/

3、Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在維持細胞生存和抑制細胞凋亡中起關(guān)鍵作用。在多種腫瘤細胞中均存在PI3K/Akt通路的異?；罨?，許多細胞毒藥物通過抑制PI3K/Akt通路誘導(dǎo)細胞凋亡。但PI3K/Akt通路在紫草素誘導(dǎo)的肺癌細胞凋亡中的作用尚未見報道。
　　Cbl屬泛素化連接酶E3，它參與多種信號通路的傳導(dǎo)并影響細胞功能。Cbl參與了MAPK、胰島素通路及PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)。Cbl是否參與了紫草素誘導(dǎo)的A549細胞凋亡尚未有報道。<

4、br>　　目前關(guān)于紫草素誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡機制的研究尚未有報道。本實驗以非小細胞肺癌A549細胞為模型，在紫草素誘導(dǎo)其凋亡過程中對Bax、Bcl-2及p53等蛋白表達的情況進行了研究，同時對PI3k/Akt通路上游分子泛素連接酶Cbl-b及c-Cbl在此過程中的調(diào)控機制進行了初步探討。
　　材料和方法:
　　1、采用MTT法測定細胞活力。
　　2、采用流式細胞儀通過PI染色進行細胞周期解析。
　　3、采用流式細胞儀

5、通過AnnexinⅤ-PI雙染進行細胞凋亡檢測。
　　4、采用Hoechst33342染色，共聚焦顯微鏡下觀察細胞核染色質(zhì)凝集及核碎裂。
　　5、采用Western-blot檢測Bcl-2、Bax、p53、Akt，p-Akt、Cbl-b和c-Cbl蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1、MTT結(jié)果顯示紫草素對A549細胞的增殖抑制呈時間及劑量依賴性，24h及48h抑制細胞增殖50％的藥物濃度(IC50)分別為1.75u

6、mol/L及1.25umol/L。
　　2、PI單染流式細胞儀檢測結(jié)果顯示紫草素誘導(dǎo)A549細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯，1.5 umol/L及1.8umol/L紫草素作用24h的G2/M期細胞百分數(shù)分別為12.65±2.24％(P＜0.05)及17.27±3.27％(P＜0.01)。
　　3、AnnexinⅤ-PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡分析表明，紫草素作用于A549細胞24h，隨濃度的增高，早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例都逐漸

7、增加，與對照組相比差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　4、紫草素作用于A549細胞24h，經(jīng)Hoechst33342染色，共聚焦顯微鏡下觀察細胞出現(xiàn)明顯的染色質(zhì)凝集及核碎裂。
　　5、Westem-blot結(jié)果顯示紫草素能明顯上調(diào)A549細胞的p53及Bax蛋白表達，下調(diào)Bcl-2蛋白表達。
　　6、1.8umol/L的紫草素分別作用于A549細胞4-24h，p-Akt蛋白表達在4h開始下降，24h時時達最小表達，而

8、總Akt蛋白水平?jīng)]有變化，提示紫草素可抑制PI3K/Akt信號通路。預(yù)先用PI3K特異性抑制劑LY294002處理A549細胞1小時，然后加入1.8umol/L的紫草素繼續(xù)作用24h，MTT結(jié)果顯示細胞增殖抑制率由單藥紫草素組的48.06±3.21％增加至72.43±5.62％(P＜0.01)。流式分析儀顯示細胞凋亡率由17.58±2.57％增加至42.61±4.36％(P＜0.01)，而LY294002單獨作用24h僅輕度抑制A549

9、細胞增殖，誘導(dǎo)少量細胞凋亡，說明LY294002與紫草素在抑制A549細胞增殖及誘導(dǎo)凋亡方面具有協(xié)同作用。
　　7、1.8umol/L紫草素分別作用A549細胞4-24h，Wester-blot結(jié)果顯示Cbl-b及c-Cbl蛋白表達在4h時開始增加，24小時時達最大表達，兩者上調(diào)時間與Akt活性被抑制的時間一致。用PS-341預(yù)處理細胞1小時，加入1.8umol/L紫草素繼續(xù)作用24h，結(jié)果顯示，PS-341逆轉(zhuǎn)了紫草素對Akt活

10、性的抑制作用及對A549細胞凋亡的誘導(dǎo)作用，提示Cbl-b及c-Cbl通過負性調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路參與了紫草素誘導(dǎo)的A549細胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　1、紫草素以時間和劑量依賴性方式抑制肺癌A549細胞增殖。
　　2、紫草素能夠誘導(dǎo)A549發(fā)生G2/M期阻滯及細胞凋亡，同時上調(diào)了p53及Bax蛋白表達，下調(diào)了Bcl-2蛋白表達。
　　3、紫草素在誘導(dǎo)肺癌A549細胞凋亡過程中抑制了PI3K/Akt通路，