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文檔簡介
1、第一部分、急性肺損傷大鼠PAI-1與相關(guān)因子的表達及其意義
背景:急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性進行性缺氧性呼吸衰竭,病死率高。研究表明炎癥是ALI發(fā)病的中心環(huán)節(jié),炎癥和肺組織重塑及膠原的沉積是同時進行的。纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)是纖溶酶原激活劑主要的抑制物,其基因表達水平與肺中膠原沉積密切相關(guān)。PAI-1還通過作用于基質(zhì)金屬酶、肝細胞生長因子、
2、細胞遷移等影響肺損傷修復(fù)。
目的:探索急性肺損傷大鼠PAI-1表達的變化規(guī)律,以便尋找合適的干預(yù)手段和時機;初步探討PAI-1相關(guān)因子的表達情況及其在急性肺損傷中的意義。
方法:4~5周清潔級SD雄性大鼠(180~200g)隨機分7組:生理鹽水組作為基線(B-A),內(nèi)毒素(LPS)組分別于造模2h、4h、8h、16h、24h、48h處死,即為LPS-A2h、LPS-A4h、LPS-A8h、LPS-A16h、L
3、PS-A24h、LPS-A48h組,每組大鼠8~10只。采用腹腔注射LPS0.1mg/kg16h后氣管滴入LPS1mg/kg的二次打擊方法誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型,生理鹽水組相應(yīng)予等量生理鹽水處理。測定各時點的血氣分析、肺組織病理評分、支氣管肺泡灌洗液(BALF)白細胞(WBC)計數(shù)和總蛋白(TP)、肺組織勻漿髓過氧化物酶(MPO)活性和丙二醛(MDA)含量、肺濕干重比(B-A、LPS-A4h、LPS-A24h組另取6只)。酶聯(lián)免疫吸附試
4、驗(ELISA)測定血漿和BALF中PAI-1水平,實時熒光定量PCR測定肺組織PAI-1及尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、肝細胞生長因子(HGF)mRNA表達水平,免疫組化法測定肺組織PAI-1及uPA、MMP-9、HGF蛋白表達水平,改良的MSB染色法進行肺纖維素染色。
結(jié)果:
1.急性肺損傷模型的建立:LPS二次打擊2h后動脈血氧分壓(PaO2)下降,4h、8h達谷底
5、,直至48h均低于基線水平。肺部病理顯示二次打擊2h即出現(xiàn)急性肺損傷表現(xiàn),4h病變加重彌漫,高峰持續(xù)至24~48h,表現(xiàn)有炎性細胞浸潤、肺泡內(nèi)和間質(zhì)出血,肺水腫、肺實變不張等。BALF WBC計數(shù)和肺組織MPO活性,BALF TP均在2h上升高于基線水平,漸達高峰持續(xù)至24~48h,與病理評分變化一致。肺組織MDA含量在4h上升,漸達高峰持續(xù)至24~48h(P<0.05)。肺濕干重比4h有上升趨勢,24h有進一步加重的趨勢,統(tǒng)計學(xué)上無顯
6、著差異(P>0.05)。
2.肺組織PAI-1的表達情況:LPS二次打擊后2h血漿PAI-1濃度有上升趨勢,8h~16h高于基線水平;而BALF PAI-1水平和肺組織PAI-1蛋白表達水平在二次打擊2h直至48h均高于基線水平(P<0.05),并有進行性加重的趨勢;PAI-1mRNA表達在二次打擊2h時開始增高,高峰持續(xù)于2~16h(P<0.05),48h恢復(fù)至基線水平。血漿與BALF PAI-1濃度、肺組織PAI-1
7、mRNA和蛋白表達水平均相互呈正相關(guān),其中血漿、BALF PAI-1水平、肺組織PAI-1蛋白的表達與肺病理評分呈正相關(guān)(P<0.05)。
3.肺組織PAI-1相關(guān)因子的表達情況:
①LPS二次打擊后uPA mRNA表達水平很快增高,2h達高峰(P<0.05),但4h即降至基線水平;uPA蛋白表達水平有2h上升、4h下降的趨勢(P>0.05),8h后uPA蛋白表達水平均低于2h,24h時最低,低于基線水平(P
8、<0.05)。
②PAI-1/uPAmRNA在LPS二次打擊2h時較基線水平增高,8h~16h達高峰,直至48h仍高于基線水平(P<0.05),肺組織PAI-1/uPA蛋白比值在LPS二次打擊后4h時后高于基線水平,8h及之后各時點高于4h(P<0.05)。纖維素染色顯示肺纖維蛋白沉積的變化趨勢與肺組織PAI-1蛋白和PAI-1/uPA蛋白比值的變化趨勢基本一致。PAI-1 mRNA/uPA mRNA和PAI-1/uPA蛋
9、白比值與肺病理評分呈正相關(guān)(P<0.01)。
③MMP-9 mRNA在LPS二次打擊2h有升高趨勢,之后維持在較高水平,48h有下降趨勢(P>0.05);LPS二次打擊后4h時MMP-9蛋白表達水平較基線水平增高,持續(xù)至24h(P<0.05),48h降至基線水平。
④HGF mRNA在LPS二次打擊后2h、4h有進行性上升趨勢,8h時較基線水平增高(P<0.05),24h下降至基線水平;LPS二次打擊后4h時
10、HGF蛋白較基線水平增高,持續(xù)至24h(P<0.05),48h降至基線水平(P>0.05)。
結(jié)論:
1.PAI-1在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷早期即表達增高,且持續(xù)時間相對長,與uPA之間比例失調(diào)導(dǎo)致纖溶失衡;PAI-1高表達和纖溶失衡與急性肺損傷發(fā)生發(fā)展及異常修復(fù)密切相關(guān);BALF PAI-1濃度能較好地反映肺組織PAI-1蛋白的表達,預(yù)示急性肺損傷的嚴重性。
2.MMP-9和HGF在急性肺
11、損傷中表達先增高后降低,下降時間早于PAI-1,可能影響急性肺損傷的細胞外基質(zhì)清除和肺修復(fù)過程。
第二部分、一氧化氮和高氧吸入對大鼠急性肺損傷PAI-1表達的影響及其作用
背景:急性肺損傷時由炎癥促發(fā)的凝血纖溶功能紊亂是肺泡和肺微血管纖維蛋白沉積的主要原因。纖溶和凝血紊亂影響ALI/ARDS的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后,成為治療ALI/ARDS的新目標(biāo)。PAI-1增高與ALI/ARDS肺局部纖維蛋白沉積密切相關(guān),因此抑制
12、PAI-1基因的表達可作為急性肺損傷的新的干預(yù)點。吸入一氧化氮(iNO)在臨床上作為嚴重ARDS的急救手段,往往在ARDS的晚期機械通氣等方法難以控制時使用。有研究表明早期iNO可以預(yù)防內(nèi)毒素引起的血管內(nèi)皮細胞功能失調(diào)。也有資料顯示一氧化氮(NO)可抑制PAI-1的表達。我們將采用早期iNO,探討治療劑量NO干預(yù)對急性肺損傷PAI-1表達的影響。嚴重ARDS的病人往往高濃度氧療。研究表明長時間高氧暴露的小鼠過度表達PAI-1。有動物實驗
13、提示iNO可降低長期高氧暴露下新生大鼠的病死率。iNO對高氧治療下急性肺損傷的PAI-1表達的影響尚不明了。體內(nèi)內(nèi)皮細胞、上皮細胞、血小板、中性粒細胞、巨噬細胞、神經(jīng)組織在一定刺激下由NOS合成酶(NOS)合成NO。外源性的NO勢必對內(nèi)源性NO系統(tǒng)產(chǎn)生影響,這種影響對急性肺損傷PAI-1的表達的意義值得進一步探討。
目的:探討吸入一氧化氮和高氧對內(nèi)毒素(LPS)二次打擊誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷PAI-1表達的影響及其意義;初步探
14、討吸入一氧化氮和高氧對急性肺損傷大鼠PAI-1相關(guān)因子表達的影響;探討吸入一氧化氮和高氧后急性肺損傷大鼠內(nèi)源性NO系統(tǒng)的變化及其與PAI-1表達的關(guān)系。
方法:4~5周清潔級SD雄性大鼠(180~200g)隨機分為生理鹽水對照組簡稱C,內(nèi)毒素造模組簡稱LPS。采用腹腔注射LPS0.1mg/kg16h后氣管滴入LPS1mg/kg的二次打擊方法誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型,生理鹽水組相應(yīng)予等量生理鹽水處理。造模后C組和LPS組分別隨
15、機給予吸入空氣(A)、20ppmNO(NO)、95%氧氣(O)、20ppmNO加95%氧氣(ONO)4種氣體,不同氣體干預(yù)4h、24h及干預(yù)24h觀察至造模48h。C組每個時點6~8只大鼠,LPS組每個時點8~10只。實時熒光定量PCR測定肺組織PAI-1及uPA、MMP-9、HGF mRNA表達水平,免疫組化法測定肺組織PAI-1及uPA、MMP-9、HGF蛋白表達水平;改良MSB染色法進行肺纖維素染色,HE染色肺病理評分;測定肺組織
16、總一氧化氮合酶(tNOS)、構(gòu)成型一氧化氮合酶(cNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性以及NO含量。
結(jié)果:
1.一氧化氮吸入與高氧對急性肺損傷PAI-1及相關(guān)因子表達的影響:
①肺組織PAI-1 mRNA表達在造模4h、24h時,LPS-A組和LPS-O組較相應(yīng)C組增高,iNO干預(yù)的LPS-NO組和LPS-ONO組較LPS-A和LPS-O組降低;造模48h時,LPS-A組表達降至正常對
17、照水平,而高氧干預(yù)的LPS-O組表達仍持續(xù)增高,高于C-O組,iNO干預(yù)的LPS-ONO組較LPS-O組降低(P<0.05)。
肺組織PAI-1蛋白在造模4h時,iNO干預(yù)的LPS-NO組表達低,與對照組無顯著差異,并低于其他氣體干預(yù)的LPS組(P<0.05);造模24h時,所有LPS組較相應(yīng)C組表達增高(P<0.05),iNO干預(yù)的LPS-NO組和LPS-ONO組較LPS-A組和LPS-O組有下降趨勢(P>0.05);造
18、模48h時,iNO干預(yù)的LPS-NO組和LPS-ONO組降至正常對照水平(P>0.05),LPS-NO組較其他氣體干預(yù)的LPS組降低,LPS-ONO組較LPS-O組降低(P<0.05)。
②肺組織uPA mRNA表達在造模4h、24h、48h各時點,所有LPS組與相應(yīng)C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
肺組織uPA蛋白表達在造模24h時LPS-A組和LPS-O組分別低于相應(yīng)C組(P<0.05);LPS
19、-NO組和LPS-ONO組較LPS-A組和LPS-O組升高(P<0.05)。
③肺組織PAI-1 mRNA/uPA mRNA在造模4h時,所有LPS組大鼠較相應(yīng)C組增高;造模24h、48h時,僅LPS-A組和LPS-O組高于相應(yīng)C組(P<0.05),iNO干預(yù)的LPS-NO組和LPS-ONO組已降至正常對照水平,其中造模48h時LPS-NO組和LPS-ONO組較LPS-A組和LPS-O組降低(P<0.05)。
20、 肺組織PAI-1/uPA蛋白比值在造模4h時,iNO干預(yù)的LPS-NO組比值低,與對照組比較無顯著差異(P>0.05),其他氣體干預(yù)的LPS組則高于相應(yīng)C組(P<0.05),LPS-NO組較LPS-A組,LPS-ONO組較LPS-O組有降低趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);造模24h時,所有LPS組均高于相應(yīng)C組(P<0.05),造模48h時,只有LPS-NO組降至正常對照水平;在造模24h和48h時iNO干預(yù)的LPS-NO組
21、和LPS-ONO組較LPS-A組和LPS-O組降低(P<0.05)。
④肺組織MMP-9mRNA在造模24h時,所有LPS組高于相應(yīng)C組(P<0.05);不同氣體干預(yù)的LPS組肺組織PAI-1mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
肺組織MMP-9蛋白在造模4h和24h時,所有LPS組較相應(yīng)C組有增高趨勢;造模48h時,LPS-O組高于C-O組(P<0.05),其他LPS組均在正常對照水平。
22、 ⑤肺組織HGFmRNA表達在造模4h和24h時,所有LPS組較相應(yīng)C組有增高趨勢(P>0.05),其中LPS-NO組高于C-NO組(P<0.05);造模48h時,所有LPS組HGF mRNA表達下降至正常對照水平。
肺組織HGF蛋白表達在造模4h和24h時,所有LPS組較相應(yīng)C組增高(P<0.05),造模48h時,LPS組大鼠HGF蛋白表達均降至正常對照水平。
2.iNO與高氧對急性肺損傷內(nèi)源性NO系統(tǒng)
23、的影響及與PAI-1表達的關(guān)系:
①肺組織iNOS活性在造模4h、24h和48h,所有LPS組較相應(yīng)C組均有增高趨勢,其中在4h、24h時LPS-A組和LPS-O組以及48h時LPS-A組較相應(yīng)C組增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);一氧化氮干預(yù)后iNOS活性有下降趨勢,在造模24h時LPS-NO和LPS-ONO組低于LPS-A組(P<0.05)。
②肺組織cNOS活性在造模4h和24h時,LPS-A組和
24、LPS-O組大鼠較相應(yīng)C組有下降趨勢;其中造模24h時,LPS-A組較C-A組下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),LPS-A組較其他氣體干預(yù)下的LPS組肺組織cNOS活性降低(P<0.05);造模48h時,LPS-NO組肺組織cNOS活性高于LPS-A組(P<0.05)。
③肺組織tNOS活性在造模4h時LPS組與相應(yīng)C組大鼠比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;在造模24h和48h時LPS組肺組織tNOS活性較相應(yīng)C組有增高趨勢(P
25、>0.05)。
④肺組織NO含量以NO2-和NO3-之和表示。NO含量在造模4h、48h時所有LPS組高于相應(yīng)C組(P<0.05);在造模24h時LPS-NO組NO含量下降至正常對照水平,并較其LPS-A組下降(P<0.05)。其他氣體干預(yù)的LPS組仍高于相應(yīng)C組(P<0.05)。
⑤在造模4h、24h、48h時,iNOS活性與PAI-1 mRNA和蛋白表達均呈正相關(guān)(P<0.05),而cNOS活性與PAI-
26、1 mRNA和蛋白表達均呈負相關(guān)(P<0.05)。在各時點,肺組織NO含量與PAI-1 mRNA和蛋白表達均呈正相關(guān)(P<0.05)。
3.一氧化氮吸入與高氧對肺組織病理學(xué)的影響:
肺病理評分在造模4h、24h、48h各時點,所有LPS組均大于相應(yīng)C組(P<0.05)。LPS-NO組、LPS-ONO較LPS-A和LPS-O組肺病理評分有下降趨勢(P>0.05),其中24h時,LPS-NO組較LPS-A組下降差
27、異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
肺組織纖維素染色C組肺組織未見明顯纖維蛋白沉著,LPS組可見肺泡腔,小血管腔及間質(zhì)有纖維蛋白沉積,LPS-NO組和LPS-ONO組較LPS-A組和LPS-O組有所減輕。
結(jié)論:
1.早期20ppmNO吸入可抑制內(nèi)毒素所致大鼠急性肺損傷PAI-1的高表達,糾正高氧暴露后PAI-1高表達延長,緩解纖溶失衡,減輕肺損傷,同時也為臨床急性肺損傷早期iNO干預(yù)治療提供實驗
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