急性肺損傷大鼠PAI-1的表達(dá)與一氧化氮吸入干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、急性肺損傷大鼠PAI-1與相關(guān)因子的表達(dá)及其意義
　　 背景：急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，病死率高。研究表明炎癥是ALI發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，炎癥和肺組織重塑及膠原的沉積是同時進(jìn)行的。纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)是纖溶酶原激活劑主要的抑制物，其基因表達(dá)水平與肺中膠原沉積密切相關(guān)。PAI-1還通過作用于基質(zhì)金屬酶、肝細(xì)胞生長因子、

2、細(xì)胞遷移等影響肺損傷修復(fù)。
　　 目的：探索急性肺損傷大鼠PAI-1表達(dá)的變化規(guī)律，以便尋找合適的干預(yù)手段和時機(jī)；初步探討PAI-1相關(guān)因子的表達(dá)情況及其在急性肺損傷中的意義。
　　 方法：4～5周清潔級SD雄性大鼠(180～200g)隨機(jī)分7組：生理鹽水組作為基線(B-A)，內(nèi)毒素(LPS)組分別于造模2h、4h、8h、16h、24h、48h處死，即為LPS-A2h、LPS-A4h、LPS-A8h、LPS-A16h、L

3、PS-A24h、LPS-A48h組，每組大鼠8～10只。采用腹腔注射LPS0.1mg/kg16h后氣管滴入LPS1mg/kg的二次打擊方法誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型，生理鹽水組相應(yīng)予等量生理鹽水處理。測定各時點(diǎn)的血?dú)夥治觥⒎谓M織病理評分、支氣管肺泡灌洗液(BALF)白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)和總蛋白(TP)、肺組織勻漿髓過氧化物酶(MPO)活性和丙二醛(MDA)含量、肺濕干重比(B-A、LPS-A4h、LPS-A24h組另取6只)。酶聯(lián)免疫吸附試

4、驗(yàn)(ELISA)測定血漿和BALF中PAI-1水平，實(shí)時熒光定量PCR測定肺組織PAI-1及尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)mRNA表達(dá)水平，免疫組化法測定肺組織PAI-1及uPA、MMP-9、HGF蛋白表達(dá)水平，改良的MSB染色法進(jìn)行肺纖維素染色。
　　 結(jié)果：
　　 1.急性肺損傷模型的建立：LPS二次打擊2h后動脈血氧分壓(PaO2)下降，4h、8h達(dá)谷底

5、，直至48h均低于基線水平。肺部病理顯示二次打擊2h即出現(xiàn)急性肺損傷表現(xiàn)，4h病變加重彌漫，高峰持續(xù)至24～48h，表現(xiàn)有炎性細(xì)胞浸潤、肺泡內(nèi)和間質(zhì)出血，肺水腫、肺實(shí)變不張等。BALF WBC計(jì)數(shù)和肺組織MPO活性，BALF TP均在2h上升高于基線水平，漸達(dá)高峰持續(xù)至24～48h，與病理評分變化一致。肺組織MDA含量在4h上升，漸達(dá)高峰持續(xù)至24～48h(P<0.05)。肺濕干重比4h有上升趨勢，24h有進(jìn)一步加重的趨勢，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯

6、著差異(P>0.05)。
　　 2.肺組織PAI-1的表達(dá)情況：LPS二次打擊后2h血漿PAI-1濃度有上升趨勢，8h～16h高于基線水平；而BALF PAI-1水平和肺組織PAI-1蛋白表達(dá)水平在二次打擊2h直至48h均高于基線水平(P<0.05)，并有進(jìn)行性加重的趨勢；PAI-1mRNA表達(dá)在二次打擊2h時開始增高，高峰持續(xù)于2～16h(P<0.05)，48h恢復(fù)至基線水平。血漿與BALF PAI-1濃度、肺組織PAI-1

7、mRNA和蛋白表達(dá)水平均相互呈正相關(guān)，其中血漿、BALF PAI-1水平、肺組織PAI-1蛋白的表達(dá)與肺病理評分呈正相關(guān)(P<0.05)。
　　 3.肺組織PAI-1相關(guān)因子的表達(dá)情況：
　　 ①LPS二次打擊后uPA mRNA表達(dá)水平很快增高，2h達(dá)高峰(P<0.05)，但4h即降至基線水平；uPA蛋白表達(dá)水平有2h上升、4h下降的趨勢(P>0.05)，8h后uPA蛋白表達(dá)水平均低于2h，24h時最低，低于基線水平(P

8、<0.05)。
　　 ②PAI-1/uPAmRNA在LPS二次打擊2h時較基線水平增高，8h～16h達(dá)高峰，直至48h仍高于基線水平(P<0.05)，肺組織PAI-1/uPA蛋白比值在LPS二次打擊后4h時后高于基線水平，8h及之后各時點(diǎn)高于4h(P<0.05)。纖維素染色顯示肺纖維蛋白沉積的變化趨勢與肺組織PAI-1蛋白和PAI-1/uPA蛋白比值的變化趨勢基本一致。PAI-1 mRNA/uPA mRNA和PAI-1/uPA蛋

9、白比值與肺病理評分呈正相關(guān)(P<0.01)。
　　 ③MMP-9 mRNA在LPS二次打擊2h有升高趨勢，之后維持在較高水平，48h有下降趨勢(P>0.05)；LPS二次打擊后4h時MMP-9蛋白表達(dá)水平較基線水平增高，持續(xù)至24h(P<0.05)，48h降至基線水平。
　　 ④HGF mRNA在LPS二次打擊后2h、4h有進(jìn)行性上升趨勢，8h時較基線水平增高(P<0.05)，24h下降至基線水平；LPS二次打擊后4h時

10、HGF蛋白較基線水平增高，持續(xù)至24h(P<0.05)，48h降至基線水平(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.PAI-1在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷早期即表達(dá)增高，且持續(xù)時間相對長，與uPA之間比例失調(diào)導(dǎo)致纖溶失衡；PAI-1高表達(dá)和纖溶失衡與急性肺損傷發(fā)生發(fā)展及異常修復(fù)密切相關(guān)；BALF PAI-1濃度能較好地反映肺組織PAI-1蛋白的表達(dá)，預(yù)示急性肺損傷的嚴(yán)重性。
　　 2.MMP-9和HGF在急性肺

11、損傷中表達(dá)先增高后降低，下降時間早于PAI-1，可能影響急性肺損傷的細(xì)胞外基質(zhì)清除和肺修復(fù)過程。
　　 第二部分、一氧化氮和高氧吸入對大鼠急性肺損傷PAI-1表達(dá)的影響及其作用
　　 背景：急性肺損傷時由炎癥促發(fā)的凝血纖溶功能紊亂是肺泡和肺微血管纖維蛋白沉積的主要原因。纖溶和凝血紊亂影響ALI/ARDS的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后，成為治療ALI/ARDS的新目標(biāo)。PAI-1增高與ALI/ARDS肺局部纖維蛋白沉積密切相關(guān)，因此抑制

12、PAI-1基因的表達(dá)可作為急性肺損傷的新的干預(yù)點(diǎn)。吸入一氧化氮(iNO)在臨床上作為嚴(yán)重ARDS的急救手段，往往在ARDS的晚期機(jī)械通氣等方法難以控制時使用。有研究表明早期iNO可以預(yù)防內(nèi)毒素引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)。也有資料顯示一氧化氮(NO)可抑制PAI-1的表達(dá)。我們將采用早期iNO，探討治療劑量NO干預(yù)對急性肺損傷PAI-1表達(dá)的影響。嚴(yán)重ARDS的病人往往高濃度氧療。研究表明長時間高氧暴露的小鼠過度表達(dá)PAI-1。有動物實(shí)驗(yàn)

13、提示iNO可降低長期高氧暴露下新生大鼠的病死率。iNO對高氧治療下急性肺損傷的PAI-1表達(dá)的影響尚不明了。體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血小板、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)組織在一定刺激下由NOS合成酶(NOS)合成NO。外源性的NO勢必對內(nèi)源性NO系統(tǒng)產(chǎn)生影響，這種影響對急性肺損傷PAI-1的表達(dá)的意義值得進(jìn)一步探討。
　　 目的：探討吸入一氧化氮和高氧對內(nèi)毒素(LPS)二次打擊誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷PAI-1表達(dá)的影響及其意義；初步探

14、討吸入一氧化氮和高氧對急性肺損傷大鼠PAI-1相關(guān)因子表達(dá)的影響；探討吸入一氧化氮和高氧后急性肺損傷大鼠內(nèi)源性NO系統(tǒng)的變化及其與PAI-1表達(dá)的關(guān)系。
　　 方法：4～5周清潔級SD雄性大鼠(180～200g)隨機(jī)分為生理鹽水對照組簡稱C，內(nèi)毒素造模組簡稱LPS。采用腹腔注射LPS0.1mg/kg16h后氣管滴入LPS1mg/kg的二次打擊方法誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型，生理鹽水組相應(yīng)予等量生理鹽水處理。造模后C組和LPS組分別隨

15、機(jī)給予吸入空氣(A)、20ppmNO(NO)、95％氧氣(O)、20ppmNO加95％氧氣(ONO)4種氣體，不同氣體干預(yù)4h、24h及干預(yù)24h觀察至造模48h。C組每個時點(diǎn)6～8只大鼠，LPS組每個時點(diǎn)8～10只。實(shí)時熒光定量PCR測定肺組織PAI-1及uPA、MMP-9、HGF mRNA表達(dá)水平，免疫組化法測定肺組織PAI-1及uPA、MMP-9、HGF蛋白表達(dá)水平；改良MSB染色法進(jìn)行肺纖維素染色，HE染色肺病理評分；測定肺組織

16、總一氧化氮合酶(tNOS)、構(gòu)成型一氧化氮合酶(cNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性以及NO含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.一氧化氮吸入與高氧對急性肺損傷PAI-1及相關(guān)因子表達(dá)的影響：
　　 ①肺組織PAI-1 mRNA表達(dá)在造模4h、24h時，LPS-A組和LPS-O組較相應(yīng)C組增高，iNO干預(yù)的LPS-NO組和LPS-ONO組較LPS-A和LPS-O組降低；造模48h時，LPS-A組表達(dá)降至正常對

17、照水平，而高氧干預(yù)的LPS-O組表達(dá)仍持續(xù)增高，高于C-O組，iNO干預(yù)的LPS-ONO組較LPS-O組降低(P<0.05)。
　　 肺組織PAI-1蛋白在造模4h時，iNO干預(yù)的LPS-NO組表達(dá)低，與對照組無顯著差異，并低于其他氣體干預(yù)的LPS組(P<0.05)；造模24h時，所有LPS組較相應(yīng)C組表達(dá)增高(P<0.05)，iNO干預(yù)的LPS-NO組和LPS-ONO組較LPS-A組和LPS-O組有下降趨勢(P>0.05)；造

18、模48h時，iNO干預(yù)的LPS-NO組和LPS-ONO組降至正常對照水平(P>0.05)，LPS-NO組較其他氣體干預(yù)的LPS組降低，LPS-ONO組較LPS-O組降低(P<0.05)。
　　 ②肺組織uPA mRNA表達(dá)在造模4h、24h、48h各時點(diǎn)，所有LPS組與相應(yīng)C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 肺組織uPA蛋白表達(dá)在造模24h時LPS-A組和LPS-O組分別低于相應(yīng)C組(P<0.05)；LPS

19、-NO組和LPS-ONO組較LPS-A組和LPS-O組升高(P<0.05)。
　　 ③肺組織PAI-1 mRNA/uPA mRNA在造模4h時，所有LPS組大鼠較相應(yīng)C組增高；造模24h、48h時，僅LPS-A組和LPS-O組高于相應(yīng)C組(P<0.05)，iNO干預(yù)的LPS-NO組和LPS-ONO組已降至正常對照水平，其中造模48h時LPS-NO組和LPS-ONO組較LPS-A組和LPS-O組降低(P<0.05)。
　　

20、 肺組織PAI-1/uPA蛋白比值在造模4h時，iNO干預(yù)的LPS-NO組比值低，與對照組比較無顯著差異(P>0.05)，其他氣體干預(yù)的LPS組則高于相應(yīng)C組(P<0.05)，LPS-NO組較LPS-A組，LPS-ONO組較LPS-O組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模24h時，所有LPS組均高于相應(yīng)C組(P<0.05)，造模48h時，只有LPS-NO組降至正常對照水平；在造模24h和48h時iNO干預(yù)的LPS-NO組

21、和LPS-ONO組較LPS-A組和LPS-O組降低(P<0.05)。
　　 ④肺組織MMP-9mRNA在造模24h時，所有LPS組高于相應(yīng)C組(P<0.05)；不同氣體干預(yù)的LPS組肺組織PAI-1mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 肺組織MMP-9蛋白在造模4h和24h時，所有LPS組較相應(yīng)C組有增高趨勢；造模48h時，LPS-O組高于C-O組(P<0.05)，其他LPS組均在正常對照水平。
　

22、　 ⑤肺組織HGFmRNA表達(dá)在造模4h和24h時，所有LPS組較相應(yīng)C組有增高趨勢(P>0.05)，其中LPS-NO組高于C-NO組(P<0.05)；造模48h時，所有LPS組HGF mRNA表達(dá)下降至正常對照水平。
　　 肺組織HGF蛋白表達(dá)在造模4h和24h時，所有LPS組較相應(yīng)C組增高(P<0.05)，造模48h時，LPS組大鼠HGF蛋白表達(dá)均降至正常對照水平。
　　 2.iNO與高氧對急性肺損傷內(nèi)源性NO系統(tǒng)

23、的影響及與PAI-1表達(dá)的關(guān)系：
　　 ①肺組織iNOS活性在造模4h、24h和48h，所有LPS組較相應(yīng)C組均有增高趨勢，其中在4h、24h時LPS-A組和LPS-O組以及48h時LPS-A組較相應(yīng)C組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；一氧化氮干預(yù)后iNOS活性有下降趨勢，在造模24h時LPS-NO和LPS-ONO組低于LPS-A組(P<0.05)。
　　 ②肺組織cNOS活性在造模4h和24h時，LPS-A組和

24、LPS-O組大鼠較相應(yīng)C組有下降趨勢；其中造模24h時，LPS-A組較C-A組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LPS-A組較其他氣體干預(yù)下的LPS組肺組織cNOS活性降低(P<0.05)；造模48h時，LPS-NO組肺組織cNOS活性高于LPS-A組(P<0.05)。
　　 ③肺組織tNOS活性在造模4h時LPS組與相應(yīng)C組大鼠比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在造模24h和48h時LPS組肺組織tNOS活性較相應(yīng)C組有增高趨勢(P

25、>0.05)。
　　 ④肺組織NO含量以NO2-和NO3-之和表示。NO含量在造模4h、48h時所有LPS組高于相應(yīng)C組(P<0.05)；在造模24h時LPS-NO組NO含量下降至正常對照水平，并較其LPS-A組下降(P<0.05)。其他氣體干預(yù)的LPS組仍高于相應(yīng)C組(P<0.05)。
　　 ⑤在造模4h、24h、48h時，iNOS活性與PAI-1 mRNA和蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)(P<0.05)，而cNOS活性與PAI-

26、1 mRNA和蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。在各時點(diǎn)，肺組織NO含量與PAI-1 mRNA和蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)(P<0.05)。
　　 3.一氧化氮吸入與高氧對肺組織病理學(xué)的影響：
　　 肺病理評分在造模4h、24h、48h各時點(diǎn)，所有LPS組均大于相應(yīng)C組(P<0.05)。LPS-NO組、LPS-ONO較LPS-A和LPS-O組肺病理評分有下降趨勢(P>0.05)，其中24h時，LPS-NO組較LPS-A組下降差

27、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 肺組織纖維素染色C組肺組織未見明顯纖維蛋白沉著，LPS組可見肺泡腔，小血管腔及間質(zhì)有纖維蛋白沉積，LPS-NO組和LPS-ONO組較LPS-A組和LPS-O組有所減輕。
　　 結(jié)論：
　　 1.早期20ppmNO吸入可抑制內(nèi)毒素所致大鼠急性肺損傷PAI-1的高表達(dá)，糾正高氧暴露后PAI-1高表達(dá)延長，緩解纖溶失衡，減輕肺損傷，同時也為臨床急性肺損傷早期iNO干預(yù)治療提供實(shí)驗(yàn)