清開靈注射液不良反應(yīng)性質(zhì)及發(fā)生機(jī)制的初步研究.pdf

1、清開靈注射液具有清熱解毒、化痰通絡(luò)、鎮(zhèn)靜安神和醒腦開竅的功效,在臨床上使用廣泛。但隨著臨床應(yīng)用日益增多,清開靈注射液的不良反應(yīng)報(bào)告也逐漸增加。找出清開靈注射液中致不良反應(yīng)的主要物質(zhì),是清開靈注射液安全使用的關(guān)鍵。
　　 目前報(bào)道的清開靈注射液不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為用藥30 min內(nèi)即可發(fā)生藥物熱、皮膚反應(yīng)或過敏性休克,同時(shí)還可能出現(xiàn)血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的不良反應(yīng)及精神癥狀,表現(xiàn)為速發(fā)型過敏反應(yīng)。但也有不少患者的不良反應(yīng)發(fā)生于

2、第一次用藥時(shí),即無用藥史,缺乏對機(jī)體的致敏過程,它不具備Ⅰ型過敏反應(yīng)的發(fā)生條件。近年來不少學(xué)者把這類不良反應(yīng)納入類過敏反應(yīng)的范疇。類過敏反應(yīng)是非IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒、釋放大量生物活性物質(zhì),從而引起系列過敏癥狀的反應(yīng)。而引起類過敏反應(yīng)發(fā)生的途徑有兩條,一是直接刺激肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞脫顆粒,二是通過經(jīng)典途徑和旁路途經(jīng)激活補(bǔ)體,使過敏毒素C3a和C5a增多,刺激肥大細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞脫顆粒。
　　 因此,確定清開靈注射液在臨床引

3、發(fā)的不良反應(yīng)性質(zhì)及其發(fā)生機(jī)制是找出致不良反應(yīng)主要物質(zhì)的首要條件。本論文從藥物毒性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)著手,結(jié)合體外肥大細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)和體外補(bǔ)體激活的測定進(jìn)行研究,為清開靈注射液不良反應(yīng)的深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1、初步判斷清開靈注射液在臨床上引發(fā)的不良反應(yīng)性質(zhì)類型,主要區(qū)分毒性反應(yīng)、過敏反應(yīng)和類過敏反應(yīng)。
　　 2、初步研究清開靈注射液在臨床上引發(fā)的不良反應(yīng)發(fā)生機(jī)制,主要判斷與補(bǔ)體系統(tǒng)激活的關(guān)系。
　　

4、 方法:
　　 1、單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)(1)血常規(guī)檢測和組織病理學(xué)檢查:昆明小鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,分別通過尾靜脈注射的方式給予藥物,即相當(dāng)于清開靈注射液人臨床最大給藥劑量的1、5、10、15倍四個(gè)不同劑量的藥液和生理鹽水。給藥前均禁食不禁水12 h,給藥后正常飼養(yǎng)14 d。試驗(yàn)期間觀察指標(biāo)包括動(dòng)物體重變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物、死亡情況及中毒反應(yīng)等。對瀕死及死亡動(dòng)物及時(shí)進(jìn)行解剖,其他動(dòng)物在觀察期結(jié)束后抽樣采血

5、進(jìn)行血常規(guī)檢測(計(jì)數(shù)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板,測定血紅蛋白),采用One—Way ANOVA方法比較組間各指標(biāo)是否有差異。同時(shí)對動(dòng)物進(jìn)行解剖,當(dāng)發(fā)現(xiàn)器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時(shí),則對改變的器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。(2)血清電解質(zhì)檢測:Wistar大鼠隨機(jī)分為藥液組(10倍劑量清開靈注射液)和生理鹽水對照組,每組8只。給藥前禁食不進(jìn)水12 h,通過腹腔注射給藥,給藥5 min后水合氯醛麻醉,斷頭采血進(jìn)行血清電解質(zhì)檢測(K+、Na+、Ca

6、2+含量)。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),比較兩組間各指標(biāo)是否有差異。
　　 2、體外溶血實(shí)驗(yàn)(1)體外溶血:按照藥典相關(guān)內(nèi)容,用新鮮兔血配制2％紅細(xì)胞懸液,利用酶標(biāo)儀在570nm波長下檢測血紅素的吸光值,通過計(jì)算分別考察不同批號的清開靈注射液、不同自制和廠家來源的拆方組分藥液的體外溶血作用,每藥液組設(shè)立1、5、10、15倍四個(gè)濃度。采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析比較主效應(yīng)組間是否有差異,不同濃度下的組間多重比較用LSD方法。(2)多次給藥后

7、體外溶血:Balb/C小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,每組6只,分別腹腔注射5倍劑量的清開靈注射液和生理鹽水,隔日1次,共3次。于首次給藥后的第15 d,斷頭采血,分別制備2％紅細(xì)胞懸液,考察不同濃度的清開靈注射液對其溶血作用。采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析比較主效應(yīng)組間是否有差異。
　　 3、肥大細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)(1)以PBS為空白對照,在不同濃度清開靈注射液與RBL-2H3細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后,通過MTT方法考察藥液對細(xì)胞生長的影響。(2

8、)不同藥液分別與RBL-2H3細(xì)胞共孵育45min后,吸取上清,通過對其中過敏活性物質(zhì)組胺的釋放量或者β-氨基己糖苷酶的凈釋放度的計(jì)算,考察不同濃度、不同批號的清開靈注射液以及不同自制和廠家來源的拆方組分藥液對肥大細(xì)胞的脫顆粒作用,以Tyrode’s液為陰性對照,采用One—Way ANOVA方法,比較不同組別間是否有差異。
　　 4、體外血清補(bǔ)體激活實(shí)驗(yàn)人血清分別與PBS、清開靈注射液與在體外共孵育,通過檢測血清補(bǔ)體系統(tǒng)激活最

9、終產(chǎn)物SC5b-9的含量,考察藥液對血清補(bǔ)體激活的作用,采用配對樣本t檢驗(yàn),比較PBS、清開靈注射液兩組間是否有差異。同時(shí)考察不同孵育濃度和時(shí)間的影響,采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析比較主效應(yīng)組間是否有差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)在給藥后很短時(shí)間內(nèi),隨藥物劑量增加,小鼠出現(xiàn)乏力、抽搐、昏迷甚至死亡的不同反應(yīng)；與生理鹽水空白組比較,15倍劑量組小鼠在血常規(guī)檢測中紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白含量有顯著性差異,小于空白

10、組(F=10.973,P=0.008；F=9.445,P=0.011)；在病理切片中顯示肺部充血明顯；用藥組小鼠血清電解質(zhì)(K+、Na+、Ca2+)含量與生理鹽水對照組無顯著性差異(t=0.404,P=0.692；t=-0.352,P=0.730；t=-0.803,P=0.436)。
　　 2、體外溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)合觀察結(jié)果以及通過吸光值計(jì)算的結(jié)果來看,自制拆方組分金銀花、梔子以及藥廠來源拆方組分水牛角&珍珠母的混合提取液具有溶血作用

11、,藥廠來源拆方組分黃芩苷以及兩種來源的金銀花、梔子、珍珠母和板藍(lán)根在較大濃度的時(shí)候(5倍及以上)均能引起紅細(xì)胞的凝集。不同批號的清開靈注射液中,在較大濃度(10倍及以上)時(shí),除批號為812903A、811704A的藥液外(兩者來自同一個(gè)藥廠),其他批號的都能引起溶血；批號為811704A和070702的注射液能引起輕度凝集。清開靈注射液在體外對多次給藥的實(shí)驗(yàn)組、對照組Balb/C小鼠的溶血度無顯著性差異(F=0.022,P=0.882)

12、。
　　 3、肥大細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)在對RBL-2H3細(xì)胞生長的影響上,各清開靈組、PBS空白組間有顯著性差異(F=593.247,P=0.000)。其中清開靈注射液濃度在1/960～2/15(V/V))之間時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)作用,而濃度高于2/15(V/V))時(shí)則抑制其生長。與Tyrode’s液陰性組比較,不同濃度的清開靈注射液對RBL-2H3細(xì)胞組胺釋放量和β-氨基己糖苷酶凈釋放度有顯著性差異、不同批號的清開靈注射液對β-氨基己糖苷酶

13、釋放度有顯著性差異(P<0.05),表現(xiàn)為促進(jìn)作用。但僅2/9個(gè)批號的促進(jìn)釋放作用強(qiáng)于陽性組。清開靈注射液自制拆方組分(濃度均為1/10(V/V))除珍珠母外,對RBL-2H3細(xì)胞β-氨基己糖苷酶凈釋放均具有促進(jìn)作用,其中金銀花促釋放作用最強(qiáng)(F=17024.728,P=0.000)。清開靈注射液藥廠來源拆方組分(濃度均為1/10(V/V))對RBL-2H3細(xì)胞β-氨基己糖苷酶凈釋放均具有促進(jìn)作用,其中金銀花和梔子促釋放作用最強(qiáng)(F=2

14、517.163,P=0.000)。
　　 4、體外血清補(bǔ)體激活實(shí)驗(yàn)與PBS緩沖液相比,清開靈注射液和人血清1/1(V/V)在體外振蕩孵育30min后,血清補(bǔ)體末端復(fù)合物SC5b-9的含量有顯著性差異,但清開靈組的含量低于PBS藥液組(t=2.897,P=0018)。同時(shí)不同孵育濃度、不同孵育時(shí)間組間比較F=3.436,P=0.066;F=1.97,P=0.182。
　　 結(jié)論:清開靈注射液在臨床上的不良反應(yīng),不能簡單歸于