近紅外光譜法在高通量分析還原型谷胱甘肽片理化性質(zhì)中的應(yīng)用研究.pdf

1、本文建立了一種運(yùn)用近紅外光譜法(near infrared spectroscopy，NIRS)結(jié)合偏最小二乘法(partial least squares，PLS)高通量、高選擇性測定還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)片中雜質(zhì)氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）及片劑抗張強(qiáng)度(radial tensilestrength，RTS)的方法。為了建立和評價預(yù)測模型，采用優(yōu)化的測

2、量參數(shù)，準(zhǔn)確測量了330片還原型谷胱甘肽片的近紅外漫反射和透射光譜。
　　在GSSG或RTS的分析過程中，進(jìn)行了近紅外漫反射光譜(nearinfrared diffuse reflectance spectrum，NIR-DRS)和近紅外透射光譜(nearinfrared transmittance spectrum，NIR-TS)的篩選，校正集和預(yù)測集的合理篩分，采用化學(xué)計量學(xué)技術(shù)對光譜進(jìn)行預(yù)處理。在選擇了建模光譜范圍和去除異常

3、光譜后，用最佳的主因子數(shù)建立模型。用校正集均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）、交叉驗證均方根誤差(root mean square error of cross validation，RMSECV)、預(yù)測集均方根誤差(root mean square error of prediction，RMSEP)、校正集的相關(guān)系數(shù)（correlation coefficient o

4、f calibration，Rc）和預(yù)測集的相關(guān)系數(shù)（correlation coefficient of prediction，Rp）對所建模型的性能進(jìn)行評價。結(jié)果表明，所建立的近紅外分析模型性能優(yōu)良。因此可證明NIRS結(jié)合PLS可同時地、選擇性地、快速無損地分析還原型谷胱甘肽片中的雜質(zhì)GSSG的含量和片劑物理參數(shù)RTS，盡管片劑中主藥GSH的含量非常高，而雜質(zhì)GSSG的含量很低。此策略可作為對常用的藥物制劑中主要成分的近紅外光譜法在

5、線分析的一個重要補(bǔ)充，同時也擴(kuò)展了近紅外光譜法在高通量和高選擇性分析方向的運(yùn)用。
　　目的:
　　1.建立還原型谷胱甘肽片中主要雜質(zhì)GSSG含量的NIR-DRS快速測定法，用于質(zhì)量控制。
　　2.建立還原型谷胱甘肽片物理參數(shù)RTS的NIR-DRS快速測定法，用于質(zhì)量控制。
　　方法:
　　1.還原型谷胱甘肽片近紅外光譜的測量
　　將片劑一面放置于FT-NIR光譜儀的積分球附件檢測窗，用片劑漫透射采樣附

6、件調(diào)節(jié)片劑位置使固定于檢測窗中心，同時采集樣品的NIR-DRS和NIR-TS。然后，采用同樣的方式對片劑另一面進(jìn)行光譜測量。所有的光譜測量均采用下述測量條件。分辨率:8 cm-1;掃描次數(shù):64;掃描范圍:漫反射光譜10000-4000 cm-1，透射光譜10000-6000 cm-1;溫度:約25℃;濕度:（55±5）％RH。每次測量前掃描并扣除背景以避免空氣中水蒸氣和二氧化碳的影響。
　　2.還原型谷胱甘肽片中GSSG含量參考

7、值的測定
　　用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定，并按外標(biāo)法計算GSSG的含量參考值。色譜柱:C18柱(Phenomenex Gemini,250 mm×4.6 mm，5μm)，柱溫:30℃，流動相:甲醇-緩沖液（10 mmol/L庚烷磺酸鈉水溶液，50 mmol/L磷酸二氫鈉水溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）(4∶96，v/v)，流速:1 mL/min，檢

8、測波長:210nm，進(jìn)樣量:20μL。根據(jù)ICH-Q2(R1)中分析方法的驗證標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法學(xué)驗證。
　　3.還原型谷胱甘肽片RTS參考值的測定
　　用游標(biāo)卡尺測量每片樣品的直徑（t）和厚度（D），用片劑硬度測試儀測定每片樣品的硬度(F)，然后根據(jù)公式(1)計算每片樣品的RTS參考值。RTS=2F/πDt(1)
　　4.建立基于NIR-DRS的GSSG含量的PLS預(yù)測模型并對模型進(jìn)行驗證
　　對NIR-DRS和NI

9、R-TS進(jìn)行選擇，然后合理的篩分校正集和預(yù)測集，采用化學(xué)計量學(xué)技術(shù)對光譜進(jìn)行預(yù)處理。在選擇了建模光譜范圍和去除異常光譜后，用最佳的主因子數(shù)建立基于NIR-DRS的GSSG預(yù)測模型。用RMSEC、RMSECV、RMSEP、Rc和Rp對所建模型的性能進(jìn)行評價。
　　5.建立基于NIR-DRS的RTS的PLS預(yù)測模型并對模型進(jìn)行驗證
　　對NIR-DRS和NIR-TS進(jìn)行選擇，然后合理的篩分校正集和預(yù)測集，采用化學(xué)計量學(xué)技術(shù)對光譜

10、進(jìn)行預(yù)處理。在選擇了建模光譜范圍和去除異常光譜后，用最佳的主因子數(shù)建立基于NIR-DRS的RTS預(yù)測模型。用RMSEC、RMSECV、RMSEP、Rc和Rp對所建模型的性能進(jìn)行評價。
　　結(jié)果:
　　1.近紅外光譜的測量
　　得到330片還原型谷胱甘肽片樣品的660張NIR-DRS和660張NIR-TS。
　　2.氧化型谷胱甘肽含量參考值的測定
　　GSH和GSSG的分離度符合要求。GSSG的濃度(0.44

11、-16.34μg/mL)和峰面積之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程A=16.85 C-0.823（A為對照品峰面積，C對照品濃度）R2=1。平均回收率為100.3％(n=9)，RSD為1.3％。方法學(xué)驗證結(jié)果表明，HPLC可準(zhǔn)確測定GSSG的含量。
　　測得186個還原型谷胱甘肽片樣品的GSSG含量參考值范圍為15.81-22.20 mg/g。
　　3.抗張強(qiáng)度參考值的測定
　　測得318個還原型谷胱甘肽片樣品的RTS參考

12、值范圍為270.76-1145.14kPa。
　　4.GSSG預(yù)測模型性能評價
　　最優(yōu)的GSSG預(yù)模型中，RMSEC、RMSECV和RMSEP分別為0.575、0.729和0.607 mg/g，Rc和Rp分別為0.9173和0.9182。預(yù)測集參考值和預(yù)測值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程y=0.8614 x+2.6982。
　　5.RTS預(yù)測模型性能評價
　　最優(yōu)的RTS預(yù)測模型中，RMSEC、RMSECV和RMS

13、EP分別為58.2、61.3和69.0 kPa，Rc和Rp分別0.9393和0.9151。預(yù)測集參考值和預(yù)測值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程y=0.8211x+113.3224。
　　結(jié)論:
　　所建方法可高通量無損快速地測定還原型谷胱甘肽片中主要雜質(zhì)GSSG的含量和片劑的RTS。所建模型具有低的預(yù)測誤差，以及較高的相關(guān)系數(shù)。表明NIR-DRS結(jié)合PLS可高通量選擇性的測定還原型谷胱甘肽片中低含量的GSSG和片劑的物理參數(shù)RTS