基于質(zhì)譜的疾病標記物高靈敏度生物傳感新方法研究.pdf

1、近年來，生物傳感與生化分析新方法的研究進展，極大地推動了分析化學與生命科學的學科發(fā)展，在分析化學和生命科學的交叉領域，無論在科學研究方面還是實際應用都發(fā)揮著越來越重要的作用。質(zhì)譜技術是近些年來發(fā)展迅速的生物分析技術之一。質(zhì)譜作為生物活性分子的檢測手段，具有多種優(yōu)點:高靈敏度，可測定納摩爾以下物質(zhì)的量;快速，數(shù)分鐘內(nèi)即可完成測試;能同時提供精確分子質(zhì)量和結(jié)構信息;既可以定性分析，也可以用于定量分析;有效地與各種色譜分離技術聯(lián)用。質(zhì)譜的特點

2、可以概括為靈敏、快速、專一、高通量，充分展示了質(zhì)譜比其它方法優(yōu)越。本論文以質(zhì)譜為研究平臺，建立了多種生物傳感新方法。以具有重要生物功能和研究意義以及重大疾病相關的生物標志物為研究對象，發(fā)展了一系列簡單、快速、成本低、穩(wěn)定性好，且具有高靈敏度、高選擇性和高通量的新型生物傳感方法。研究論文的主要內(nèi)容如下:
　　第2章提出了DNA目標序列碎片化質(zhì)譜檢測DNA甲基化水平的方法。無需經(jīng)過鏈擴增方法，將目標DNA鏈水解后釋放出單個堿基，單個堿

3、基的質(zhì)譜靈敏度遠高于DNA鏈的質(zhì)譜靈敏度。納升電噴霧離子源(Nano ESI)的流速遠低于毫升/分鐘，離子化效率同時得到大大提高。結(jié)合Nano ESI，DNA水解物由流動注射直接進樣并質(zhì)譜檢測，5-甲基胞嘧啶(5mC)的檢出限達0.11 pM。采用經(jīng)濟的甲酸水解法，水解效率高，便于實現(xiàn)。DNA水解物混合溶液無需經(jīng)過色譜分離即可高靈敏度檢測，實驗操作過程簡單，快捷。以前列腺癌相關基因的CpG島特定序列為研究對象，通過質(zhì)譜準確測定了20個臨

4、床組織樣本的甲基化水平。
　　第3章將目標序列碎片化質(zhì)譜檢測的方法應用到DNA重復序列拷貝數(shù)的檢測中。重復序列的動態(tài)突變不僅可以發(fā)生在上代的生殖細胞中從而遺傳至下一代，也可在當代的體細胞中發(fā)生突變。研究已發(fā)現(xiàn)，重復序列的動態(tài)突變與多種神經(jīng)性疾病相關，是當前研究熱點之一。利用PCR擴增方法提高目標重復序列的濃度，PCR引物上標記生物素。鏈霉親和素磁珠與PCR產(chǎn)物中的生物素結(jié)合，目標重復序列被磁珠捕獲純化。隨后，目標重復序列從磁珠上釋

5、放下來，甲酸水解。得到的水解物以質(zhì)譜檢測，胞嘧啶堿基的檢測限為18.23 fM。測定單個CAG拷貝數(shù)時，所需基因組DNA最小量為0.07μg，完全滿足臨床檢測要求。
　　第4章以脂質(zhì)體納米粒子對蛋白質(zhì)疾病標記物進行標記，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的高靈敏度免疫質(zhì)譜檢測。蛋白質(zhì)疾病標記物在臨床醫(yī)學上具有非常重要的作用，是指示疾病發(fā)生、疾病狀態(tài)以及疾病變化的重要指標。但是一些蛋白質(zhì)含量非常低，特別是在血液、尿液等基質(zhì)復雜的樣品中，檢測難度大。磷脂酰膽

6、堿類磷脂易于電離，質(zhì)譜靈敏度高。將其制備成脂質(zhì)體，并對目標蛋白質(zhì)進行標記編碼，不僅可以對目標蛋白進行信號放大，也可以同時檢測多組分目標蛋白質(zhì)。通過磁珠捕獲臨床樣本中待測蛋白質(zhì)，并加入已標記檢測抗體的脂質(zhì)體，得到免疫夾心復合物。無需移去磁珠，以基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF)直接檢測磁珠上的脂質(zhì)體，從而得知目標蛋白質(zhì)的濃度。前列腺特異性抗原(PSA)與癌胚抗原(CEA)的檢出限分別為0.03 ng/mL和0.2 ng

7、/mL，能夠有效區(qū)分臨床正常值與異常值，在臨床樣本的檢測中也證實了方法的可行性。質(zhì)譜提供的精確質(zhì)量數(shù)提高了對蛋白質(zhì)的鑒定能力，避免了酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)所存在的假陽性結(jié)果。
　　第5章開發(fā)了目標核酸的超靈敏質(zhì)譜計數(shù)檢測方法。在疾病癥狀尚未出現(xiàn)前，人體中已存在極微量的核酸生物標記物，是臨床上極為重要的診斷指標。但是，現(xiàn)有的分析方法難以檢測到超低含量的核酸標記物。可見，建立超靈敏的核酸檢測方法顯得尤為迫切以及重要。脂質(zhì)體具有