家蠶微粒子病的PCR檢測技術(shù)研究.pdf

1、家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis，簡稱Nb)是由Nageli于1857年從家蠶中發(fā)現(xiàn)并命名的人類所認識的第一種微孢子蟲，其引發(fā)的家蠶微粒子病是蠶業(yè)生產(chǎn)的毀滅性疾病，被確定為世界養(yǎng)蠶地區(qū)唯一的檢疫病害。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其檢測技術(shù)經(jīng)歷了肉眼觀察發(fā)病狀態(tài)、光學(xué)顯微鏡檢測、免疫學(xué)檢測和PCR檢測等方法。
　　 目前，PCR方法已被廣泛應(yīng)用于各種微生物和病害的檢測，其是最有可能突破目前生產(chǎn)中應(yīng)用的光學(xué)顯微鏡檢測瓶頸而得到廣

2、泛應(yīng)用的技術(shù)。面對蠶業(yè)生產(chǎn)中光學(xué)顯微鏡檢測Nb的缺陷和不足，初步建立Nb的PCR檢測體系。本文主要從Nb孢子DNA提取和特異性引物設(shè)計兩方面對PCR技術(shù)在家蠶微粒子病的檢測應(yīng)用進行研究，并對生產(chǎn)中帶毒雜交蠶種進行初步應(yīng)用。通過比較K2CO3發(fā)芽法、TEK發(fā)芽法和破碎法三種Nb孢子DNA抽提方法發(fā)現(xiàn)：破碎法的DNA提取效率極顯著(p<0.01)，同時對影響Nb孢子破碎率的破碎轉(zhuǎn)速、破碎時間和破碎珠比例三因素進行多重比較檢驗(LSD法)，得

3、出Nb孢子及蠶卵的最優(yōu)破碎組合：玻璃珠與陶瓷珠比例為3:1的混合珠，6500 r/min破碎3min。前人進行Nb孢子PCR檢測引物的特異性和靈敏度研究，最高檢測靈敏度可達3.25×10-5ng DNA水平，而本實驗室重新設(shè)計的特異性引物檢測靈敏度可達6×10-7ng DNA水平。
　　 將獲得的最優(yōu)組合，對蠶業(yè)生產(chǎn)中帶毒雜交種和人為添食不同感染時期及感染劑量Nb的5齡蠶所產(chǎn)蠶卵進行PCR檢測，二者結(jié)果較為一致。結(jié)果顯示：帶毒雜

4、交蠶種，在催青第1d即可進行陽性檢測，隨著蠶卵的發(fā)育，PCR陽性檢測率無明顯的升高，且單粒蠶卵的檢測陽性率高于10粒、20粒蠶卵。不同感染時期和感染劑量家蠶所產(chǎn)蠶卵的PCR檢測結(jié)果未發(fā)現(xiàn)明顯差異。
　　 純孢子和模擬實驗結(jié)果顯示，PCR檢測技術(shù)可以滿足帶毒蠶卵早期檢測的要求，但由于生產(chǎn)樣本及抽樣的復(fù)雜性，在實際檢測中仍存在一定的不足，有待于繼續(xù)研究。本文對微孢子的PCR檢測從DNA提取到引物設(shè)計進行了系統(tǒng)的實驗和分析，為PCR技