微粒子侵染家蠶組織的PCR檢測(cè).pdf

1、家蠶微孢子蟲(chóng)寄生家蠶能讓家蠶感染微粒子病，這種微粒子病嚴(yán)重影響到家蠶的蠶種生產(chǎn)情況，是蠶種產(chǎn)業(yè)中惟一的檢疫病。家蠶幼蟲(chóng)早期感染這種病會(huì)在結(jié)繭前死亡，如果感染較晚，則會(huì)將微孢子蟲(chóng)垂直傳播給子代，進(jìn)而對(duì)整個(gè)蠶桑產(chǎn)業(yè)造成巨大的損失。
　　對(duì)于微孢子蟲(chóng)在家蠶中的垂直傳播，國(guó)內(nèi)外蠶桑學(xué)研究專(zhuān)家如三谷賢三郎和黃自然等都研究了蠶卵的發(fā)病規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)研究了家蠶胚胎中的微孢子蟲(chóng)的發(fā)病規(guī)律，家蠶毒卵在反轉(zhuǎn)期前，其中的胚胎感染率達(dá)到60％以上這時(shí)其孵化

2、率應(yīng)該低于40%，但孵化率卻達(dá)到66%，顯然家蠶胚胎的感染不是以反轉(zhuǎn)期為界限的。
　　PCR方法對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)檢測(cè)有許多其他檢測(cè)方法所不具有的優(yōu)點(diǎn)，只要家蠶微孢子蟲(chóng)的基因組進(jìn)行了復(fù)制就能夠被檢測(cè)出來(lái)，因此在檢測(cè)時(shí)期上比其他檢測(cè)方法更具有優(yōu)勢(shì)。為了檢測(cè)家蠶幼蟲(chóng)的各個(gè)組織在添食微孢子蟲(chóng)后受到微孢子蟲(chóng)的侵染時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)用P50家蠶品種做為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用微量注射器定量注射等量的微孢子蟲(chóng)到五齡起家蠶的中腸中，在接添家蠶微孢子蟲(chóng)后每過(guò)6h、1

3、2h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、168h，解剖特定時(shí)間點(diǎn)的家蠶獲取中腸組織、絲腺組織、生殖腺組織、馬氏管組織以及表皮組織。每個(gè)樣用PBS緩沖液漂洗兩遍然后定量稱(chēng)取100mg，用動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒抽提各個(gè)樣品的基因組DNA，測(cè)定濃度后保存于-20℃?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)所需引物是根據(jù)家蠶微孢子蟲(chóng)的大概317bp的特異性序列設(shè)計(jì)而成，由上海生工合成，特異性引物跑出的條帶清晰且為單一條帶。結(jié)果顯示在家蠶接種微孢子

4、蟲(chóng)后24小時(shí)家蠶幼蟲(chóng)組織中的中腸組織能檢測(cè)到微孢子蟲(chóng)的特異性條帶，48小時(shí)能檢測(cè)出絲腺組織中的微孢子蟲(chóng)條帶，72小時(shí)能檢測(cè)到生殖腺組織、馬氏管組織以及表皮組織中的特異性微孢子蟲(chóng)條帶。
　　用熒光定量PCR測(cè)定家蠶各組織中的微孢子蟲(chóng)隨時(shí)間的增殖規(guī)律，實(shí)驗(yàn)樣品為上述家蠶各組織中確定帶有微孢子蟲(chóng)的組織的基因組 DNA，定量引物為內(nèi)參引物β-GAPDH和目的基因引物β-tubulin，引物擴(kuò)增之后只有一條條帶，引物特異性強(qiáng)。引物的溶解曲線