微粒子侵染家蠶組織的PCR檢測.pdf

1、家蠶微孢子蟲寄生家蠶能讓家蠶感染微粒子病，這種微粒子病嚴(yán)重影響到家蠶的蠶種生產(chǎn)情況，是蠶種產(chǎn)業(yè)中惟一的檢疫病。家蠶幼蟲早期感染這種病會在結(jié)繭前死亡，如果感染較晚，則會將微孢子蟲垂直傳播給子代，進(jìn)而對整個蠶桑產(chǎn)業(yè)造成巨大的損失。
　　對于微孢子蟲在家蠶中的垂直傳播，國內(nèi)外蠶桑學(xué)研究專家如三谷賢三郎和黃自然等都研究了蠶卵的發(fā)病規(guī)律，本實驗研究了家蠶胚胎中的微孢子蟲的發(fā)病規(guī)律，家蠶毒卵在反轉(zhuǎn)期前，其中的胚胎感染率達(dá)到60％以上這時其孵化

2、率應(yīng)該低于40%，但孵化率卻達(dá)到66%，顯然家蠶胚胎的感染不是以反轉(zhuǎn)期為界限的。
　　PCR方法對家蠶微孢子蟲檢測有許多其他檢測方法所不具有的優(yōu)點(diǎn)，只要家蠶微孢子蟲的基因組進(jìn)行了復(fù)制就能夠被檢測出來，因此在檢測時期上比其他檢測方法更具有優(yōu)勢。為了檢測家蠶幼蟲的各個組織在添食微孢子蟲后受到微孢子蟲的侵染時間，本實驗用P50家蠶品種做為實驗對象，采用微量注射器定量注射等量的微孢子蟲到五齡起家蠶的中腸中，在接添家蠶微孢子蟲后每過6h、1

3、2h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、168h，解剖特定時間點(diǎn)的家蠶獲取中腸組織、絲腺組織、生殖腺組織、馬氏管組織以及表皮組織。每個樣用PBS緩沖液漂洗兩遍然后定量稱取100mg，用動物基因組DNA抽提試劑盒抽提各個樣品的基因組DNA，測定濃度后保存于-20℃?zhèn)溆谩嶒炈枰锸歉鶕?jù)家蠶微孢子蟲的大概317bp的特異性序列設(shè)計而成，由上海生工合成，特異性引物跑出的條帶清晰且為單一條帶。結(jié)果顯示在家蠶接種微孢子

4、蟲后24小時家蠶幼蟲組織中的中腸組織能檢測到微孢子蟲的特異性條帶，48小時能檢測出絲腺組織中的微孢子蟲條帶，72小時能檢測到生殖腺組織、馬氏管組織以及表皮組織中的特異性微孢子蟲條帶。
　　用熒光定量PCR測定家蠶各組織中的微孢子蟲隨時間的增殖規(guī)律，實驗樣品為上述家蠶各組織中確定帶有微孢子蟲的組織的基因組 DNA，定量引物為內(nèi)參引物β-GAPDH和目的基因引物β-tubulin，引物擴(kuò)增之后只有一條條帶，引物特異性強(qiáng)。引物的溶解曲線