家蠶微粒子病熒光定量PCR檢測技術(shù)研究.pdf

1、家蠶微粒子病作為產(chǎn)業(yè)中唯一的檢疫對象，其檢測技術(shù)備受重視。目前生產(chǎn)中以光學(xué)顯微鏡檢測技術(shù)為檢疫實驗手段，該技術(shù)或基于該技術(shù)的檢疫評判存在諸多不足，由此基于免疫學(xué)和分子生物學(xué)的檢測技術(shù)研發(fā)得到關(guān)注。已有大量研究表明PCR檢測技術(shù)是一種諸多性能優(yōu)于光學(xué)顯微鏡檢測的檢疫實驗手段，但針對蛾或卵等實際樣本是否可行，有待大量的科學(xué)試驗進行證實。為此，本研究開展了基于熒光定量PCR檢測技術(shù)檢測蠶卵的相關(guān)試驗，主要結(jié)果如下。
　　1、以純化家蠶微

2、粒子蟲孢子為檢測對象，常規(guī)提取核酸，針對小亞基核糖體的Nb-ssu1092F和Nb-ssu1227R為引物，質(zhì)粒及家蠶微粒子蟲DNA為標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品，建立了反應(yīng)體系為20μL的熒光定量PCR檢測法，其靈敏度為0.1顆家蠶微粒子蟲孢子。
　　2、蠶卵和家蠶微粒子蟲孢子不同數(shù)量混合的兩因素?zé)晒舛縋CR檢測試驗結(jié)果為:家蠶微粒子蟲孢子數(shù)為107顆時，與13顆或以上蠶卵混合后無檢測信號;孢子數(shù)為104顆以上時，與7顆蠶卵混合后可檢出，但

3、Ct值極顯著高于純化孢子陽性對照（P=0.004）;孢子數(shù)為102顆以上時，與4顆蠶卵混合后的檢測Ct值與純化孢子陽性對照無顯著差異(P=0.871)。即蠶卵對家蠶微粒子蟲的熒光定量PCR檢測有顯著影響，但減少蠶卵數(shù)量可消除其影響。
　　3、該檢測法對單粒蠶卵中混入家蠶微粒子蟲孢子的檢測靈敏度為10顆，變異系數(shù)小于5％;對感染母蛾所產(chǎn)蠶卵的單粒檢測比較試驗顯示其檢出率顯著高于光鏡檢測法（P=0.000）。
　　4、感染母蛾所