家蠶微孢子蟲(chóng)檢測(cè)及微粒子病預(yù)報(bào)研究——家蠶微孢子蟲(chóng)單克隆抗體的制備及其應(yīng)用初探.pdf

1、微孢子蟲(chóng)(microsporidia)是自然界普遍分布的一類(lèi)細(xì)胞內(nèi)專(zhuān)性寄生的單細(xì)胞真核生物，寄主范圍從無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物，包括人類(lèi)，其感染經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)及水產(chǎn)動(dòng)物并能造成了不同程度的經(jīng)濟(jì)損失。目前已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的微孢子蟲(chóng)約有1400余種，分別歸入160多個(gè)屬[1]。家蠶微孢子蟲(chóng)(Nosema bombycis)是1857年人類(lèi)首次鑒定出的微孢子蟲(chóng)，它能夠引發(fā)家蠶微粒子病，并通過(guò)胚胎垂直傳播，是蠶業(yè)生產(chǎn)上的毀滅性病害，被列為蠶業(yè)生產(chǎn)國(guó)唯一的法定

2、檢疫對(duì)象。19世紀(jì)中葉，歐洲各國(guó)有多次微粒子病的流行的記錄，蠶業(yè)生產(chǎn)損失慘重。目前，我國(guó)蠶業(yè)生產(chǎn)每年因微粒子病和帶毒種造成的直接經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)數(shù)千萬(wàn)元。因此，防控微粒子病是蠶業(yè)界研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前對(duì)于微粒子病的檢測(cè)主要方法有三類(lèi)：顯微鏡檢法、分子生物學(xué)檢測(cè)方法和血清學(xué)檢測(cè)方法。目前生產(chǎn)上還是使用150多年前創(chuàng)立的母蛾袋檢法，具有直觀、簡(jiǎn)單，經(jīng)培訓(xùn)后方便掌握。不足之處是耗費(fèi)大量的人力、物力，形態(tài)相近但物種不同、毒力不同的微孢子不易區(qū)分

3、。為了解決這一生產(chǎn)中的問(wèn)題，結(jié)合目前血清學(xué)診斷技術(shù)的新進(jìn)展，我們希望研發(fā)出基于免疫膠體金層析快速檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)新方法。本研究就是以快速檢測(cè)家蠶微粒子病為實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，制備家蠶微孢子蟲(chóng)的單克隆抗體，并初步探討抗體在家蠶微孢子蟲(chóng)的快速檢測(cè)上的可能應(yīng)用。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.家蠶微孢子蟲(chóng)發(fā)芽液蛋白抗原的單克隆抗體制備及鑒定
　　 采用差速離心和梯度密度離心純化家蠶微孢子蟲(chóng)，通過(guò)碳酸鉀處理，使孢子彈出極絲并釋放孢原質(zhì)(即發(fā)芽

4、過(guò)程)，制備發(fā)芽液蛋白抗原；用發(fā)芽液蛋白抗原以75μg/只的劑量免疫BALB/c小鼠，四次免疫后，間接ELISA法測(cè)定小鼠抗血清效價(jià)為1:6.4×103。取免疫小鼠的脾細(xì)胞和NS0骨髓瘤細(xì)胞融合，融合率為97.7％，陽(yáng)性率為3.2％；2次亞克隆后，得到3株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1D6-A10,1D6-E12和4D2-D5。取1D6-A10,1D6-E12雜交瘤細(xì)胞株注入小鼠腹腔誘生腹水，獲得的小鼠腹水經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，

5、抗體效價(jià)分別為1：6.4×105和1:1.28×106，4D2-D5,的細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體效價(jià)為1:5.12×102。通過(guò)Western blot對(duì)3種單抗鑒定，發(fā)現(xiàn)3種單抗都相同的能和發(fā)芽液蛋白中的兩條蛋白有明顯的雜交反應(yīng)，一條約30kDa,另一條約18kDa，可能3種單克隆抗體針對(duì)同一個(gè)抗原位點(diǎn)。
　　 2.針對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白SWP32的單克隆抗體的制備及鑒定
　　 采用差速離心和梯度密度離心純化家蠶微孢子蟲(chóng)，

6、通過(guò)碳酸鉀處理使孢子發(fā)芽，再通過(guò)梯度密度離心純化孢子發(fā)芽后的空孢殼，抽提孢子的孢壁蛋白；通過(guò)SDS-PAGE電泳，挖取本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)鑒定過(guò)的孢壁蛋白SWP32，再經(jīng)電洗脫純化，用純化的SWP32以75μg/只的劑量免疫BALB/c小鼠，四次免疫后，間接ELISA法測(cè)定小鼠抗血清效價(jià)為1:5.12×104。取免疫小鼠的脾細(xì)胞和NS0骨髓瘤細(xì)胞融合，間接ELISA篩選出一株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為C7，注入小鼠體內(nèi)誘生腹水，間接EL

7、ISA測(cè)得小鼠腹水抗體效價(jià)和細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價(jià)分別1:1.28×106和1:2.56×103。通過(guò)Western blot對(duì)單抗C7鑒定，發(fā)現(xiàn)單抗C7能特異性地和SWP32蛋白結(jié)合，單抗C7的IFAT結(jié)果顯示，未能觀察到微孢子蟲(chóng)表面有熒光反應(yīng)，可能是單克隆抗體C7所針對(duì)的抗原位點(diǎn)并未暴露在家蠶微孢子蟲(chóng)的表面。
　　 3.家蠶微孢子蟲(chóng)單克隆抗體的初步應(yīng)用
　　 用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，并標(biāo)記家蠶微孢子蟲(chóng)單克隆抗體。

8、結(jié)合免疫層析技術(shù)，用點(diǎn)膜的方法將待檢樣品點(diǎn)在硝酸纖維膜上，通過(guò)金標(biāo)抗體在膜上流動(dòng)和抗原結(jié)合，形成肉眼可見(jiàn)的顯色反應(yīng)。對(duì)處理的純化的家蠶微孢子蟲(chóng)和感染的家蠶及母蛾樣品進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用點(diǎn)膜的方法加樣0.5μL來(lái)檢測(cè)家蠶微孢子蟲(chóng)，純化的家蠶微孢子蟲(chóng)的檢出度可以達(dá)到8.0×106個(gè)/mL，高倍鏡下約30個(gè)孢子/視野，病蠶研磨液中的檢出度可以達(dá)到1.5×107個(gè)/mL，約60個(gè)孢子/視野。感染家蠶母蛾的研磨液，需要經(jīng)過(guò)差速離心后，才能被