囊泡運(yùn)輸相關(guān)蛋白FgMon1及其結(jié)合蛋白FgRab5-7在小麥赤霉病菌生長發(fā)育及致病過程中的功能研究.pdf

1、小麥赤霉病是小麥生產(chǎn)上一種重要的真菌病害，在世界各產(chǎn)麥國普遍發(fā)生。小麥赤霉病發(fā)病時導(dǎo)致小麥穗部呈現(xiàn)白穗癥狀，并導(dǎo)致谷粒感病。在造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的同時，感病麥粒中含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol)和玉米赤霉烯酮(zearalenon)等真菌毒素，食用后嚴(yán)重威脅著人、畜的生命健康。然而目前還沒有有效方法來控制赤霉病的發(fā)生，現(xiàn)階段主要利用殺菌劑來防治赤霉病，但大規(guī)模的使用化學(xué)藥劑給環(huán)境及生物帶來不利影響。因此，解析小麥赤霉

2、病菌的致病分子機(jī)制，可為尋找新的赤霉病菌防治方法提供理論依據(jù)。
　　在真核生物的內(nèi)膜系統(tǒng)中，囊泡攜帶著蛋白、脂質(zhì)等物質(zhì)，從供體運(yùn)送到受體，在這個過程中膜融合作用起著重要作用。Mon1和Ccz1是在細(xì)胞質(zhì)向液泡定向運(yùn)輸途徑(Cvt)中首先被發(fā)現(xiàn)的基因，更深入的研究表明Mon1和Ccz1在酵母液泡的同型融合和調(diào)控囊泡運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用。近期的文章表明，Mon1-Ccz1作為Rab7的鳥甘酸交換因子(GEF)調(diào)控胞吞作用。
　

3、　本文通過同源序列比對，在小麥赤霉病菌基因組數(shù)據(jù)庫中找到一個與酵母MON1同源的基因，命名為FgMON1。通過系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)Mon1在絲狀真菌的進(jìn)化過程中是保守的。通過對小麥赤霉病菌中的FgMON1敲除后發(fā)現(xiàn)其在小麥赤霉病菌的生長發(fā)育、有性生殖和致病性及毒素的產(chǎn)生中起著重要作用。另外，我們還發(fā)現(xiàn)FgMon1參與小麥赤霉病菌的分生孢子的產(chǎn)生、孢子形態(tài)建成和菌絲細(xì)胞壁完整性過程。通過FM4-64染色發(fā)現(xiàn)ΔFgmon1突變體胞吞作用延緩，

4、CMAC染色發(fā)現(xiàn)突變體液泡融合受阻、細(xì)胞自噬過程受到影響。進(jìn)而對FgMon1蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要定位在小麥赤霉病菌分生孢子的液泡及胞質(zhì)中，這可能與其參與液泡融合、細(xì)胞自噬作用相關(guān)。通過酵母雙雜交和體外GST-pull down發(fā)現(xiàn)FgMon1與Rab GTPaseFgRab7存在互作關(guān)系。對FgRAB7敲除后發(fā)現(xiàn)其在小麥赤霉病菌的生長、致病性、膜泡融合及自噬過程中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FgMon1與FgRab7Q6

5、7L、FgRab7T22N都有互作關(guān)系。FgMon1可能作為FgRab7的GEF，能夠?qū)gRab7激活。上述結(jié)果表明，F(xiàn)gMon1與FgRab7作為關(guān)鍵組分調(diào)控囊泡運(yùn)輸、胞吞作用和細(xì)胞自噬，進(jìn)而影響小麥赤霉病菌的生長發(fā)育、致病性和毒素的產(chǎn)生。
　　在酵母和哺乳動物細(xì)胞中，早期內(nèi)涵體發(fā)育成熟為晚期內(nèi)涵體需要Rab5到Rab7的轉(zhuǎn)化，Mon1-Ccz1復(fù)合物能被Rab5-GTP招募到晚期內(nèi)涵體膜上，同時Mon1-Ccz1作為Rab7

6、的GEF，能夠招募Rab7并將其激活，從而促進(jìn)囊泡通過晚期內(nèi)涵體到液泡中進(jìn)行降解。為了探究Rab5-Mon1-Rab7作用模塊在小麥赤霉病菌囊泡運(yùn)輸過程中的作用，首先通過酵母雙雜發(fā)現(xiàn)FgMon1與Rab5在小麥赤霉病菌中的同源蛋白FgRab5A、FgRab5B都相互作用，進(jìn)而對FgRAB5A、FgRAB5B的功能進(jìn)行分析。利用同源重組原理，通過基因敲除的方法獲得相應(yīng)的突變體。結(jié)果表明Fgrab5A、Fgrab5B影響小麥赤霉病菌的營養(yǎng)生

7、長、有性生殖、分生孢子形成、致病力及毒素的合成，并且參與調(diào)控小麥赤霉病菌的液泡融合與胞吞作用。由此推測，F(xiàn)gMon1與FgRab5A、FgRab5B、FgRab7作為一個模塊共同調(diào)控囊泡運(yùn)輸、胞吞作用和細(xì)胞自噬，進(jìn)而影響小麥赤霉病菌的生長發(fā)育、致病性和毒素的產(chǎn)生。
　　綜上所述，Rab蛋白、GEF和效應(yīng)蛋白SNARE蛋白構(gòu)成了一個Rab蛋白調(diào)控囊泡運(yùn)輸?shù)淖饔媚K。本文通過對小麥赤霉病菌中囊泡運(yùn)輸作用模塊相關(guān)基因FgMON1、FgR