蛋白激酶A調(diào)控玉米大斑病菌生長發(fā)育及侵染的功能研究.pdf

1、玉米大斑病菌作為重要的絲狀病原真菌在病菌生物學(xué)、遺傳變異、生理分化、發(fā)育調(diào)控、致病性等方面已被廣泛研究。研究報道，由異三聚體G蛋白介導(dǎo)的cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對植物病原真菌的生長發(fā)育及致病性有重要的調(diào)控作用。其中蛋白激酶A作為cAMP下游的靶蛋白，通過磷酸化下游靶標(biāo)蛋白發(fā)揮調(diào)控絲狀真菌的形態(tài)建成及致病性的作用。本課題組前期分別獲得2個編碼蛋白激酶A催化亞基的基因StpkaC1和StpkaC2的敲除突變體，突變體均表現(xiàn)為生長速率上升、產(chǎn)孢缺

2、陷及黑色素含量下降。為進(jìn)一步明確蛋白激酶A催化亞基PKA-C調(diào)控病菌菌絲生長發(fā)育及黑色素生物合成方面的功能，本研究構(gòu)建了StpkaC2的回復(fù)載體及StpkaC1敲除載體，通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)創(chuàng)制StpkaC2回復(fù)突變體和StpkaC1/StpkaC2雙基因缺失突變體。通過對菌絲體生長、分生孢子形成、黑色素含量、分生孢子萌發(fā)、附著胞形成及穿透、菌絲附著胞膨壓等表型特征進(jìn)行分析，明確基因功能。對StpkaC2敲除突變體及野生型菌

3、株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，明確StpkaC2對菌絲體發(fā)育、黑色素生物合成、分生孢子發(fā)育相關(guān)功能基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用。此外，通過qRT-PCR技術(shù)分析了敲除PKA-C編碼基因?qū)τ薪z分裂原激活蛋白激酶(MAPKs)及鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶（CaMKs）轉(zhuǎn)錄水平的影響，明確cAMP途徑與MAPK、Ca2+途徑的交叉互作關(guān)系。主要結(jié)果如下:
　　1、StpkaC1/StpkaC2雙基因缺失突變體生長速率較野生型快，與△StpkaC2突變體相近

4、，且不產(chǎn)分生孢子;StpkaC2回復(fù)突變體生長速率與野生型相近，能產(chǎn)孢，但產(chǎn)孢量低于野生型。
　　2、StpkaC1/StpkaC雙基因缺失突變體黑色素含量顯著低于野生型及各單突菌株。基因敲除使黑色素合成相關(guān)基因表達(dá)水平明顯下調(diào)，雙突轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)尤為明顯。
　　3、突變體中，△StpkaC1最早形成附著胞，△StpkaC1/△StpkaC2最晚。但△StpkaC2比△StpkaC1的侵染菌絲形成早，△StpkaC1/△Stpk

5、aC2不能形成侵染菌絲。誘導(dǎo)36h，WT菌株、△StpkaC1、△StpkaC2、△StpkaC1/△StpkaC2突變體附著胞形成率依次為76％、26％、8％、5％，突變體與WT相比均差異顯著;誘導(dǎo)48 h，WT、△StpkaC1、△StpkaC2、△StpkaC1/△StpkaC2侵染絲形成率依次為49％、2％、8％、0，差異也很顯著。測定各菌株附著胞膨壓結(jié)果顯示，△StpkaC1、△StpkaC2膨壓為4.7 MPa左右，明顯低于

6、WT(膨壓5.45 MPa)，雙突△StpkaC1/△StpkaC2附著胞膨壓最低，為4.08 MPa左右。
　　4、qRT-PCR分析顯示，在菌絲形成附著胞階段，△StpkaC2菌株中STK1、STK3、CaMK1、CaMK2基因表達(dá)顯著上調(diào);CaMK3、CaMK4基因表達(dá)下調(diào);STK2基因表達(dá)無明顯變化。
　　5、對WT、△StpkaC2菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因2103個，其中，上調(diào)基因917個，下調(diào)基因

7、1186;根據(jù)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，篩選出與產(chǎn)孢、黑色素生物合成、菌絲生長相關(guān)的差異基因。其中產(chǎn)孢相關(guān)基因32個，上調(diào)基因9，下調(diào)基因23;黑色素生物合成相關(guān)基因12個，上調(diào)基因4，下調(diào)基因8;菌絲生長相關(guān)基因68個，上調(diào)基因26，下調(diào)基因42。
　　綜上所述，StpkaC2基因負(fù)調(diào)控大斑病菌菌絲體生長，StpkaC1對菌絲體生長影響不明顯;StpkaC1和StpkaC2為病菌產(chǎn)孢必須基因;StpkaC1和StpkaC2均正調(diào)