假單胞桿菌nahG和辣椒LOX基因克隆及其轉(zhuǎn)化煙草研究.pdf

1、在自然界,植物在生長發(fā)育過程中常常受到各種逆境的脅迫。在植物與各種病原微生物的協(xié)同進(jìn)化中,已經(jīng)逐漸形成一系列復(fù)雜而有效的防御反應(yīng)機(jī)制,包括植物細(xì)胞對逆境脅迫的感知、信號傳導(dǎo)及防御反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)改變等環(huán)節(jié)。其中植物應(yīng)答逆境信號傳遞受到了廣泛的關(guān)注,現(xiàn)在已知SA、JA等植物內(nèi)源激素參與了植物應(yīng)答逆境的信號傳遞,但其作用機(jī)制還不是很清楚。為了研究茄科植物防御反應(yīng)分子機(jī)制,剖析JA和SA等內(nèi)源激素在不同下游防御反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用及其可能機(jī)

2、制,本研究選擇脂氧合酶(LOX)和水楊酸羥基酶(nahG)作為靶標(biāo),分離了獲得它們的部分或全長cDNA,構(gòu)建了其表達(dá)載體并應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得了其相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因煙草植株。主要結(jié)果如下:
　　 1、從辣椒UV照射處理的辣椒(Capsicum annuum L.)為材料構(gòu)建的cDNA文庫中分離獲得LOX基因的陽性cDNA克隆,序列分析結(jié)果表明,該陽性克隆長度為285bp,含有95個(gè)氨基酸。其堿基序列和推定氨基酸序列與其他植

3、物上已經(jīng)分離和鑒定的LOX cDNA分別有92％和96％以上的同源性,推測該陽性克隆為辣椒LOX基因全長cDNA的部分序列。
　　 2、從nahG基因原核表達(dá)載體中獲得nahG基因的全長aDNA,其長度為1305個(gè)堿基,含有435個(gè)氨基酸的開放讀碼框,其堿基序列和推定氨基酸序列均與其它微生物上已經(jīng)分離和鑒定的nahG基因有92％以上的同源性,推測該陽性克隆為nahG基因的全長eDNA。
　　 3、分別構(gòu)建上述LOX基因的

4、RNAi載體和nahG基因的超表達(dá)載體,并進(jìn)行測序驗(yàn)證。
　　 4、應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,分別將上述兩個(gè)載體通過遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到煙草K326中,獲得了轉(zhuǎn)基因煙草T0代再牛植株73株,其中54株為PCR陽性植株。RT-PCR顯示,在LOX基因RNAi轉(zhuǎn)基因煙草中的LOX基因的表達(dá)受到了抑制,nahG基因在nahG基因超表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草中發(fā)生了轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　 以上轉(zhuǎn)基因植株的獲得,為分析候選基因表達(dá)與JA和SA信號途徑