假單胞桿菌pcs-突變株構(gòu)建和HrpZ基因克隆、表達與抗體制備.pdf

1、磷脂酰膽堿(PC)作為膜磷脂的一種組份與其它磷脂、膜蛋白以及其它成分相互作用共同組成細菌的膜系統(tǒng),維持細菌在特定條件下的生理代謝和行使其特定的生物學功能。膜磷脂中PC含量的增加或減少必將改變細胞膜的生理生化特性,直接或間接地影響細胞膜、細胞膜外層分子乃至整個細胞的生物學功能。細胞膜中PC缺失或摻入還有可能影響貫穿細菌內(nèi)膜和外膜的Ⅲ型分泌系統(tǒng)的功能,也有可能影響毒性蛋白的合成和轉(zhuǎn)運。因此,本實驗通過構(gòu)建Pseudomonas pcs-菌株

2、,克隆、表達、純化毒性蛋白基因hrpz,并制備多克隆抗體,以檢測PC的缺失對毒性蛋白hrpz在細菌體內(nèi)的表達和分泌是否具有影響。從而進一步說明細菌細胞膜PC的合成對細菌致病力的影響。
　　 本實驗利用Blast搜索GenBank上所有已經(jīng)報道的假單胞桿菌Pseudomonas磷脂酰膽堿合酶(pcs)基因,進行序列比對,找出pcs基因同源性比較高的保守區(qū)域,并設(shè)計簡并引物,以實驗室在土壤中篩選到的Pseudomonas593總DN

3、A為模板,PCR擴增出Pseudomonas593 pcs基因的核心DNA序列,并以這段DNA序列為探針,通過Southern雜交的方法克隆出該菌pcs的整個基因序列。通過亞克隆將克隆的pcs基因插入到表達載體pET23a上,轉(zhuǎn)化到細菌宿主細胞BL21(DE3)plysS中進行基因活性分析。結(jié)果顯示克隆到的pcs基因具有生物活性。然后利用同源重組的方法將Pseudomonas593基因組DNA上的pcs基因敲除掉,構(gòu)建得到pcs缺陷菌株

4、Pseudomonas593pcs-,Pseudomonas593菌株在加有1％膽堿的LA培養(yǎng)基中生長時能有效合成磷脂酰膽堿(PC),而Pseudomonas593pcsg-不能。在相同條件下比較兩種菌株在不同Na+離子濃度,SDS濃度,triton X-100濃度,CTAB濃度下的生長狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種菌對Na+離子的耐受性幾乎相當,當Na+離子濃度小于2％時兩種菌都能較好的生長,而當Na+離子濃度大于2％時兩種菌都很難生長。在對不同

5、去垢劑的耐受性性上,Pseudomonas593pcs-比Pseudomonas593都要強。
　　 Hrpz蛋白作為假單胞桿菌主要的毒性蛋白,在假單胞桿菌的植物致病性上起著重要的作用。根據(jù)已經(jīng)報道的丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonas syringae pv.Syringae Van Hall)的Hrpz基因序列設(shè)計引物,以丁香假單胞菌丁香致病變種的基因組DNA為模板,PCR擴增去終止密碼子的Hrpz基因全長,插入