葡萄砧木PGIP基因的克隆及轉(zhuǎn)化煙草的研究.pdf

1、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)是多種病原真菌的致病因子，是病原真菌入侵過(guò)程中分泌的第一個(gè)細(xì)胞壁降解酶。而多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalaeturonase-inhibiting protein,PGIP)是一種特異性細(xì)胞壁結(jié)合蛋白，富含抗病基因所具有的亮氨酸重復(fù)序列(Leucine-rich repeat, LRR)，非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制病原真菌PG酶的活性，減少PG對(duì)植物細(xì)胞壁的降解，誘導(dǎo)植物的抗病性

2、反應(yīng)，從而抑制了真菌病害的發(fā)生。
　　 本實(shí)驗(yàn)以‘5BB’(Vtis berlandieri×V.riparia)、‘1202’(V.vinifera× V.rupestrsis)和‘Beta’(V.riparia×V.labrusca)三種葡萄砧木為材料，克隆了‘5BB’、‘1202’和‘Beta’PGIP基因，并用生物信息學(xué)的方法分析其結(jié)構(gòu)和功能。同時(shí)構(gòu)建了‘5BB'PGIP基因的高效表達(dá)載體(pYF7704)，進(jìn)行了煙草的

3、遺傳轉(zhuǎn)化研究?，F(xiàn)將主要研究結(jié)果匯總?cè)缦拢?br>　　 1.以葡萄砧木‘5BB’、‘1202’和‘Beta’葉片為試材，通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物，PCR擴(kuò)增，從上述砧木基因組中分別得到1條全長(zhǎng)1002bp的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因序列(‘5BB’PGIP基因GenBank的登錄號(hào)：FJ530941；‘1202’PGIP基因GenBank的登錄號(hào)：GQ139363；‘Beta' PGIP基因GenBank的登錄號(hào)：GQ139364)。

4、　　 2.對(duì)‘5BB’、‘1202’和‘Beta' PGIP基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，它們都包含1個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框；均編碼333個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量分別為：37.07Kda、37.09 Kda和37.09 Kda;等電點(diǎn)分別為：8.683、8.684、8.257;疏水性和親水性分析及信號(hào)肽分析表明：第1-27個(gè)氨基酸殘基是信號(hào)肽；序列同源比對(duì)結(jié)果顯示，與歐洲葡萄、其它果樹(shù)的相應(yīng)序列同源性分別為99％和68％;其推導(dǎo)的蛋

5、白質(zhì)序列中包含一段亮氨酸重復(fù)序列，三級(jí)結(jié)構(gòu)和菜豆PGIP相似.
　　 3.將構(gòu)建好的‘5BB'PGIP基因表達(dá)載體(pYF7704)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，最終獲得102個(gè)抗性株系.經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)，從10株中擴(kuò)增出了目的條帶。進(jìn)一步的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，有5個(gè)為陽(yáng)性株系.初步證實(shí)，‘5BB'PGIP基因已經(jīng)整合到煙草的基因組中.通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因株系與未轉(zhuǎn)基因植株對(duì)照植株的SOD和CAT酶的活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)‘5BB’PGIP基