水稻APX基因的克隆及其對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX，EC1.11.1.11)，也叫做維生素C過氧化物酶，它屬于末端氧化酶的一種，主要存在于高等植物、真核藻類及某些藍(lán)細(xì)菌中，但在某些昆蟲中也檢測出到該酶活性。 APX是清除H2O2的關(guān)鍵酶，對于保護(hù)葉綠體和其他細(xì)胞組分免受H2O2及其所產(chǎn)生的羥自由基的破壞是必不可少的。當(dāng)植物體內(nèi)的H2O2積累時，能快速誘導(dǎo)APX表達(dá)，APX催化抗壞血酸與H2O2反應(yīng)，使H2O2被

2、分解。APX在植物的抗氧化脅迫中起重要作用。 在高等植物中，APX是一個多基因家族，它的同工酶定位于4個不同的區(qū)域：葉綠體中的基質(zhì)APX(sAPX)、葉綠體類囊體膜APX(tAPX)、微體APX(mbAPX)和胞質(zhì)APX(cAPX)。水稻APX基因家族共有8個成員分為3種類型：細(xì)胞質(zhì)型APX(APX1，2)；過氧化物體型APX(APX3，4)；葉綠體型APX(APX5，6，7，8)。其中細(xì)胞質(zhì)型APX(APX1，2)的研究較多。

3、其它類型研究較少，本實(shí)驗(yàn)以水稻的過氧化物體型APX(APX3，4)為主要研究對象。 以粳型水稻的cDNA為模板，根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫水稻APX3(AY382617)、APX4(NM_001068974)序列，分別設(shè)計(jì)特異引物PCR擴(kuò)增出目的片段，回收并與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，藍(lán)白篩選獲得陽性克隆。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后，測序，結(jié)果表明所得APX3序列大小為1038bp，APX4序列大小為997bp，與

4、原序列相似性達(dá)99％以上。生物信息學(xué)推定APX3編碼的蛋白大小為32.075KD，而APX4編碼的蛋白大小為31.738KD，二蛋白大小相差0.337KD；APX3的等電點(diǎn)為8.26，是堿性蛋白質(zhì)，而APX4的等電點(diǎn)為7.74，為偏中性蛋白質(zhì)；APX3的疏水平均值為-0.371，APX4的疏水平均值為-0.297，二者均是親水性蛋白質(zhì)；在穩(wěn)定性方面APX3的不穩(wěn)定系數(shù)為46.22，是一種不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，而APX4的不穩(wěn)定系數(shù)為34.55

5、，是一種穩(wěn)定蛋白；二蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)差別較大，只有α—螺旋都含有101個，而隨機(jī)卷曲螺旋及β—螺旋相差較多；但它們的三級結(jié)構(gòu)比較相似氫鍵差2個，α—螺旋與β—螺旋都相同，轉(zhuǎn)角差1個。由此可見，水稻APX3與APX4基因以及編碼的蛋白質(zhì)存在著細(xì)微的差異，但APX家族基因功能相同。 為了驗(yàn)證APX基因的功能，構(gòu)建了植物的表達(dá)載體。根據(jù)APX3、APX4基因序列分別設(shè)計(jì)帶有XbaⅠ、SacⅠ兩種酶切位點(diǎn)的正、反義引物，擴(kuò)增出帶酶切位點(diǎn)

6、的APX3，APX4基因cDNA全長并連接到已被XbaⅠ、SacⅠ酶切過缺失GUS的植物表達(dá)載體pBI121上，分別構(gòu)建了含有APX3、APX4基因cDNA全長的正、反義植物表達(dá)載體pBI121—APX3、pBI121—APX4、pBI121—AsAPX3、pBI121—AsAPX4。并將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105，用于下一步遺傳轉(zhuǎn)化。 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤轉(zhuǎn)化法，分別將APX3、APX4基因轉(zhuǎn)入模式植物煙草中。在卡那霉素選擇壓下