TRPC3參與糖氧剝奪致培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡.pdf

1、背景：
　　隨著社會人口老齡化，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率日益增高，而臨床上，對于這類疾病尚無有效控制病程進展的措施。瑞士研究者發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病與髓鞘脫失有關(guān)，進一步研究證明少突膠質(zhì)細(xì)胞退化導(dǎo)致脫髓鞘，少突膠質(zhì)細(xì)胞對缺血缺氧損傷較其他膠質(zhì)細(xì)胞敏感，在大腦的某些特定區(qū)域甚至比神經(jīng)元對缺血缺氧損傷更敏感。因此，有學(xué)者提出少突膠質(zhì)細(xì)胞的缺血缺氧損傷是神經(jīng)退行性疾病重要原因。
　　鈣離子是調(diào)節(jié)各個流程的通用第二信使，是細(xì)胞間信號傳

2、遞的關(guān)鍵離子，鈣穩(wěn)態(tài)紊亂是缺氧缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡諸多途徑的共同節(jié)點。介導(dǎo)外鈣內(nèi)流主要有：電壓依賴的和非電壓依賴的鈣通道兩種方式，瞬時受體電位通道蛋白(transient receptor potential channel，TRPC)是一類非電壓依賴跨膜蛋白，是維持Ca2+穩(wěn)態(tài)的重要離子通道。TRPC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達廣泛，參與了神經(jīng)系統(tǒng)很多重要的生理功能，其中TRPC3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達最廣泛。研究表明TRPC3異常激活可致神經(jīng)退行

3、性疾病，但是TRPC3是否參與缺血缺氧少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，目前并不清楚。
　　我們?yōu)檠芯縏RPC3是否參與缺血缺氧少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，本實驗體外培養(yǎng)少突膠質(zhì)細(xì)胞，建立少突膠質(zhì)細(xì)胞糖氧剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）模型，采用了TRPC3阻斷劑Pyr3阻斷OGD少突膠質(zhì)細(xì)胞后，檢測少突膠質(zhì)細(xì)胞存活和凋亡的變化及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變。旨在探討 TRPC3是否參與了糖氧剝奪少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，為神經(jīng)退

4、行性疾病的防治提供新的理論依據(jù)和可行的途徑。
　　方法:
　　第一部分
　　1.取SD乳鼠腦皮質(zhì)，采用兩種不同的細(xì)胞增殖法和兩種不同的分離純化法分四組培養(yǎng)，A組為細(xì)胞因子增殖聯(lián)合搖床震蕩分離純化法，B組為B104CM（the conditioned medium prepared from B104 neuroblastoma cells，B104CM）增殖聯(lián)合搖床震蕩分離純化法，C組為細(xì)胞因子增殖聯(lián)合EDTA消化機械

5、吹打分離純化法，D組為B104CM增殖聯(lián)合EDTA消化機械吹打分離純化法。倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并對各組細(xì)胞進行計數(shù)。
　　2.用A2B5和髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）檢測其少突膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性并分析其純度。
　　3.建立體外少突膠質(zhì)細(xì)胞OGD損傷模型的方法:三氣培養(yǎng)箱缺氧、無糖DMEM相結(jié)合的方法，即培養(yǎng)箱調(diào)整為（94％N2+5%CO2+1%O2)，培養(yǎng)基更換為無糖DMEM

6、，分別培養(yǎng)1h，2h，3h后取出細(xì)胞，更換為正常少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基，恢復(fù)正常的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，同時常氧常糖設(shè)置為正常對照。
　　4.細(xì)胞活力及凋亡改變的檢測：OGD1h，2h，3h后，恢復(fù)正常條件復(fù)氧培養(yǎng)24h，MTT比色法測定細(xì)胞活力變化；Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率。比較1h，2h，3h對細(xì)胞的損傷程度，確定適合少突膠質(zhì)細(xì)胞合適的OGD時間。
　　第二部分
　　1.建立體外少突

7、膠質(zhì)細(xì)胞OGD損傷模型：采用三氣培養(yǎng)箱物理缺氧與DMEM缺糖相結(jié)合構(gòu)建少突膠質(zhì)細(xì)胞OGD損傷模型。
　　2.采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測OGD損傷模型少突膠質(zhì)細(xì)胞TRPC3蛋白的表達變化。
　　3.實驗分組：以原代培養(yǎng)的新生SD大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞為對照組，以O(shè)GD少突膠質(zhì)細(xì)胞為模型組，將模型組+Pyr3阻斷組設(shè)為處理組。
　　4.MTT檢測各組細(xì)胞活力，AnnexinV-FITC試劑盒染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡。

8、r>　　5.fluo-3染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡測定各組細(xì)胞內(nèi)游離鈣的變化。
　　結(jié)果:
　　1.B104CM增殖聯(lián)合EDTA消化機械吹打分離純化法較其他三種培養(yǎng)方法收獲的OPC數(shù)量多。
　　2.少突膠質(zhì)細(xì)胞A2B5和MBP特異性標(biāo)記，細(xì)胞純度可達到95%。
　　3.MTT結(jié)果顯示，OGD1h少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活力即降低，隨著缺氧時間延長細(xì)胞活力呈降低的趨勢。流式細(xì)胞測細(xì)胞凋亡的結(jié)果表明
　　OG

9、D1h、2h、3h，細(xì)胞早期凋亡率分別為（14.43±0.20）%、（21.99±0.42）%、(44.71±0.20）%，與正常對照組（6.86±0.05）％相比，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.OGD損傷模型少突膠質(zhì)細(xì)胞TRPC3蛋白表達增加。
　　5.OGD組細(xì)胞活性為（54.34±6.55）%，凋亡率為（24.24±0.86）%，與對照組有顯著差異(P＜0.05)，Pyr3處理組細(xì)胞存活率為（72.26±5

10、.41）%，凋亡率為（14.82±0.28）%，與OGD組有顯著差異(P＜0.05)。
　　6.激光共聚焦測鈣離子濃度結(jié)果顯示，正常對照組熒光強度為（28.89±4.43）%，OGD組熒光強度為（58.05±5.80）%、處理組熒光強度為（42.26±5.44）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度結(jié)果顯示，正常對照組熒光強度為（4.15±0.65）%，OGD組熒光強度為（23.99±1.22）%，

11、處理組熒光強度為（10.54±0.73）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組結(jié)果均顯示，OGD組細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高，而加入TRPC3阻斷劑Pyr3后，胞內(nèi)鈣增加得到顯著抑制。
　　結(jié)論:
　　1.B104CM增殖聯(lián)合EDTA消化機械吹打分離純化培養(yǎng)法簡單可行，具有穩(wěn)定的可重復(fù)性，可用于少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)。
　　2.采用三氣培養(yǎng)箱物理缺氧與DMEM缺糖相結(jié)合可有效的構(gòu)建少突膠質(zhì)細(xì)胞OGD損傷模型。OGD2h可能是少突