HSP60與血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的:動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重威脅人類健康的常見疾病和多發(fā)病，它常導(dǎo)致一些致死性的心腦血管方面的疾病，例如腦梗塞、心肌梗死等。動(dòng)脈粥樣硬化在早期的病理學(xué)中被描述為一種終末期退行性疾病，它會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈管腔的廣泛性狹窄，其發(fā)生過程及其復(fù)雜，是由多種因素參與的慢性炎癥過程。其中內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成有著密切的聯(lián)系。
　　 血管平滑肌細(xì)胞(Vascularsmoothm

2、usclecell，VSMC)的表型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的關(guān)鍵因素。血管平滑肌細(xì)胞不同于其它的細(xì)胞，當(dāng)它受到外界損傷時(shí)，細(xì)胞會(huì)降低其特異性伸縮蛋白的表達(dá)，進(jìn)而能促進(jìn)細(xì)胞的增生和遷移。同時(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶的合成也會(huì)相應(yīng)的增加，此過程能促進(jìn)血管損傷的修復(fù)，如果這種修復(fù)的過程出現(xiàn)了異常，就會(huì)導(dǎo)致如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管狹窄等血管性的疾病。血管平滑肌細(xì)胞表型的變化在血管性疾病形成的過程中起著十分重要的作用。平滑肌細(xì)胞的狀態(tài)分為

3、“合成型”和“伸縮型”，這兩種狀態(tài)呈現(xiàn)此消彼長(zhǎng)的關(guān)系。當(dāng)細(xì)胞呈現(xiàn)“合成型”狀態(tài)時(shí)，其保持“伸縮型”狀態(tài)的基因處于被抑制的狀態(tài)，而與增殖遷移相關(guān)的一些基因則高表達(dá)。這種“合成型”狀態(tài)的細(xì)胞能夠分泌相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶和相關(guān)彈性蛋白，最終導(dǎo)致受損血管的修復(fù)和重塑。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、斑塊破潰的過程中，伴隨著平滑肌細(xì)胞的增生。
　　 熱休克蛋白(heatshockprotein，HSP)是生物受到外界不良刺激發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生的應(yīng)激蛋

4、白，存在于原核和真核生物中，可被免疫系統(tǒng)視為外源分子，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。這種蛋白在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡等細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了二十多種HSP。它們多以分子量命名，如HSP10、HSP20、HSP27、HSP40、HSP60、HSP70等。一些研究顯示HSP與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。如HSP27具有調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白活性、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激、抗炎等作用。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，能檢測(cè)到HSP27基因的表

5、達(dá)，由于HSP27與HSP20在結(jié)構(gòu)上具有較高的同源性，因此，HSP20在平滑肌細(xì)胞中也能大量表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的遷移、肌肉的收縮起到調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成。此外，在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者中，血清中也會(huì)檢測(cè)到HSP70的表達(dá)。有研究顯示，在兔動(dòng)脈粥樣硬化模型中，平滑肌細(xì)胞的增殖與HSP70基因表達(dá)呈正相關(guān)。隨著內(nèi)膜的增厚，HSP70基因表達(dá)水平明顯增高。
　　 現(xiàn)有的流行病學(xué)、病理學(xué)和動(dòng)物模型的研究資料表明，HSP60與A

6、S的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。研究顯示在人的動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)域中的細(xì)胞內(nèi)能檢測(cè)到內(nèi)源性HSP60，且病變的程度和HSP60的表達(dá)量成正相關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)HSP60可作為一種促炎癥性因子，在心臟病患者和不同程度的冠狀動(dòng)脈疾病患者的血清中都呈現(xiàn)不同的表達(dá)量。血清中HSP60表達(dá)水平越高，發(fā)生心血管疾病的可能性就越大。而且HSP60血清表達(dá)量越高，與患者病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。已有文獻(xiàn)提示HSP-60致AS的發(fā)生可能主要有兩方面原因:(1)生物受到各

7、種外界刺激后血管壁產(chǎn)生大量的內(nèi)源性HSP60，它作為一種自身抗原可以激發(fā)局部免疫反應(yīng)，損傷血管內(nèi)皮系統(tǒng)，促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展;(2)病原感染宿主后，針對(duì)病原體產(chǎn)生的外源抗原-抗體復(fù)合物沉積于血管壁，進(jìn)而激活補(bǔ)體，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能，誘導(dǎo)血管壁細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子及粘附因子，促進(jìn)AS進(jìn)展。HSP60作為抗原被機(jī)體的免疫體通過免疫細(xì)胞表面的受體所識(shí)別，如TLR樣受體(TLR-2或TLR-4)。許多研究報(bào)道TLR樣受體是一種小分子的HSP受體。該類受

8、體能激活NF-κB通路，進(jìn)而釋放一些促炎性因子。而TLR-4基因的突變和多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化的形成有著密切的關(guān)系。
　　 盡管許多研究顯示HSP60與AS發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，然而關(guān)于HSP60與AS形成的分子機(jī)制的研究卻鮮為報(bào)道。本研究擬通過HSP60對(duì)于大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(A7r5)增殖和遷移的作用及相關(guān)信號(hào)通路的研究，以求進(jìn)一步探尋HSP60與AS形成的分子機(jī)制，為AS發(fā)病機(jī)制的研究開拓新的領(lǐng)域。
　　 方法:(

9、1)在42℃條件下培養(yǎng)血管平滑機(jī)細(xì)胞(A7r5)1小時(shí)后，再經(jīng)過37℃培養(yǎng)24h后提取胞漿蛋白，利用Westernblot檢測(cè)HSP60的表達(dá)量，并與正常37℃培養(yǎng)A7r5細(xì)胞提取的蛋白相比較，觀察熱刺激對(duì)內(nèi)源性HSP60表達(dá)的影響;(2)BoydenChamber法觀察HSP60對(duì)細(xì)胞遷移的影響:①通過不同濃度HSP60（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml）分別刺激VSMC5h和24h，觀察其是

10、否能引起細(xì)胞的遷移，并確定最佳誘導(dǎo)細(xì)胞遷移濃度;②分別用10μmol/L、20μmol/LU0126（p-ERK抑制劑）預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)，再用10ng/mlHSP60刺激細(xì)胞24h，觀察細(xì)胞的遷移是否收到抑制;③用TLR4抗體預(yù)封閉細(xì)胞表面受體1小時(shí)，再用10ng/mlHSP60刺激細(xì)胞24h，觀察細(xì)胞遷移是否收到抑制;(3)劃痕實(shí)驗(yàn)觀察HSP60對(duì)細(xì)胞遷移的影響:用10ng/ml的HSP60刺激VSMC24h、48h后，在顯微鏡下觀察

11、細(xì)胞遷移的情況;(4)MTT方法觀察細(xì)胞增殖變化:①檢測(cè)不同濃度HSP60(1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)刺激A7r5細(xì)胞24h后，觀察對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用，確定最佳誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的濃度;②分別用10μmol/L、20μmol/LU0126預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)，觀察細(xì)胞的增殖是否收到抑制;③用TLR4抗體預(yù)封閉細(xì)胞表面受體1小時(shí)，再用10ng/mlHSP60刺激細(xì)胞24h，觀察細(xì)胞增殖是否收到抑制

12、;(5)利用10ng/mlHSP60刺激VSMC24h后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化;(6)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)在不同時(shí)間點(diǎn)(10min、30min、45min、1h、2h、4h)分別刺激VSMC后，利用Westernblot檢測(cè)p-ERK的表達(dá)量，觀察HSP60誘導(dǎo)細(xì)胞增殖及遷移的信號(hào)通路;(7)利用RealTimePCR方法，檢測(cè)HSP60誘導(dǎo)

13、細(xì)胞增殖及遷移是否通過細(xì)胞表面受體TLR2或TLR4介導(dǎo)的;(8)用TLR4抗體對(duì)A7r5細(xì)胞預(yù)處理1小時(shí)，再經(jīng)10ng/mlHSP60處理細(xì)胞24小時(shí)，通過Westernblot觀察p-ERK的表達(dá)，驗(yàn)證HSP60誘導(dǎo)細(xì)胞增殖及遷移是通過TLR4受體介導(dǎo)的。
　　 結(jié)果:(1)經(jīng)過42℃培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)后，提取蛋白與正常37℃培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的蛋白比較，內(nèi)源性HSP60表達(dá)明顯增高;(2)BoydenChamber結(jié)果顯示:①不同濃度

14、HSP60(1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)刺激VSMC后，均能誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞遷移，且細(xì)胞的遷移數(shù)量與濃度呈正相關(guān)。其中在10ng/ml的濃度，細(xì)胞的遷移量最多(P＜0.05)，因此將10ng/ml的濃度確定為最佳誘導(dǎo)濃度;②用10μmol/L及20μmol/L的U0126預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)后，細(xì)胞的遷移數(shù)量減少，其中20μmol/L的U0126預(yù)處理，細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少，表明HSP60誘導(dǎo)V

15、SMC遷移是與ERK信號(hào)途徑有關(guān);⑧TLR4抗體預(yù)封閉細(xì)胞表面受體1小時(shí)后，細(xì)胞遷移數(shù)量也明顯減少，表明HSP60誘導(dǎo)VSMC遷移與TLR4受體相關(guān);(3)劃痕結(jié)果顯示細(xì)胞在10ng/mlHSP-60刺激24h、48h后，細(xì)胞也有明顯的遷移跡象，以48h最為明顯;(4)MTT方法觀察細(xì)胞增殖結(jié)果顯示:①不同濃度HSP60（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml）刺激細(xì)胞后，在1ng/ml和5ng/ml

16、HSP60是細(xì)胞增殖變化不明顯，當(dāng)10ng/ml、20ng/mlHSP60刺激時(shí)，細(xì)胞增殖數(shù)量明顯增加(P＜0.05)，其中以10ng/mlHSP60處理細(xì)胞增殖更明顯;②不同濃度10μmol/L、20μmol/L的U0126預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)后，細(xì)胞的增殖數(shù)量明顯減少（P＜0.05）;③用TLR4抗體預(yù)封閉細(xì)胞表面受體1小時(shí)，細(xì)胞增殖數(shù)量也明顯減少(P＜0.05);(5)10ng/mlHSP60刺激細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期中的S期

17、明顯升高;(6)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)刺激VSMC后，Westemblot檢測(cè)p-ERK的表達(dá)明顯增加。其中在10ng/mlHSP60濃度時(shí)，p-ERK的表達(dá)量增加最多;不同時(shí)間點(diǎn)(10min、30min、1h、2h、4h)刺激VSMC后，p-ERK的表達(dá)量也呈增加的趨勢(shì)，在10min時(shí)，p-ERK的表達(dá)量最多;(7)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng

18、/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)刺激VSMC后，RealTimePCR方法檢測(cè)TLR-2和TLR-4受體在mRNA水平表達(dá)，結(jié)果顯示HSP60能促進(jìn)TLR-4受體表達(dá)，而不影響TLR-2受體表達(dá)。在10ng/mlHSP60刺激時(shí)，TLR-4的表達(dá)量最高;(8)用TLR4抗體封閉后，Westernblot結(jié)果顯示其p-ERK的表達(dá)量明顯下降。
　　 結(jié)論:(1)血管平滑肌細(xì)胞(A7r5)在42℃條件下能夠