大黃素抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖機(jī)制研究.pdf

1、第一部分大黃素抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖機(jī)制研究 背景：大黃素(1，3，8．三羥基．6．甲基葸醌)是天然葸醌化合物，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞增生。然而，大黃素對(duì)平滑肌細(xì)胞的作用機(jī)制研究甚少。 大黃素能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞(Mahlavu，HL-60)凋亡，Mahlavu細(xì)胞凋亡現(xiàn)象可被抗氧化劑(過(guò)氧化氫酶和環(huán)孢霉素A)部分阻斷，但是HL-60細(xì)胞凋亡現(xiàn)象不能被抗氧化劑所阻斷，因此ROS途徑是否參與大黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡存在爭(zhēng)議。大黃素在細(xì)

2、菌中常有致突變效應(yīng)(mutagenicity)，在細(xì)胞中常有基因毒性(genotoxicity)。DNA損傷促進(jìn)p53表達(dá)，p53途徑活化后既可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，又可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。ROS途徑和p53途徑是大黃素發(fā)揮作用的可能途徑。 大黃素可被細(xì)胞色素P450代謝酶(CYP)代謝轉(zhuǎn)化為2．羥基大黃素，它抑制增殖效果強(qiáng)于大黃素。CYP抑制劑或者誘導(dǎo)劑可能改變大黃素作用特點(diǎn)。方法：人血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)培養(yǎng)于M199培養(yǎng)液中。通

3、過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT法、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移等方法觀察大黃素的作用特點(diǎn)。使用AnnexinV和7-AAD雙染法、乳酸脫氫酶釋放來(lái)觀察大黃素促VSMCs死亡的方式。對(duì)于ROS途徑，利用ROS生成阻斷劑觀察大黃素促ROS生成途徑，并觀察ROS強(qiáng)度降低后VSMCs死亡方式的變化。對(duì)于p53途徑，采用p53蛋白印跡、透射電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。使用CYP阻斷劑和誘導(dǎo)劑觀察大黃素作用特點(diǎn)(抑制VSMCs增殖、促進(jìn)ROS)是否發(fā)生變化。利

4、用基因芯片觀察上述信號(hào)通路基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。 結(jié)果：(1)低濃度大黃素(3.1、6．3pg／m1)抑制VSMCs增殖，高濃度大黃素(25．0~g／m1)促進(jìn)VSMCs死亡。GOGl期細(xì)胞呈大黃素濃度依賴性增多，而S期細(xì)胞則顯著減少，25pg／ml大黃素組S期細(xì)胞較正常對(duì)照組減少達(dá)80％(7．40+1．65％vs．39．05~5．88％，p<0．05)。不同濃度大黃素均可抑制VSMCs遷移，25pg／ml抑制率為89．6％(p<

5、0．05)。(2)大黃素以持續(xù)穩(wěn)定的方式促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS生成(r=0．97，p<0．01)，NADPH氧化酶抑制劑(DPI或PDTC)可以抑制大黃素促ROS效應(yīng)，而其他抑制劑(CsA、ABT、a-NF)則無(wú)抑制效果。細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力并無(wú)明顯變化。大黃素促使VSMCs凋亡和壞死，以凋亡為主。DPI可以顯著阻斷200pM過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的VSMCs壞死和凋亡(凋亡：12．6~0．98％vs．4．0~1．00％，p<0．05，壞死：32．2~2．

6、99％vs．4．87~2．22％，p<0．05)，也能顯著阻斷大黃素促VSMCs凋亡(14．55~2．29％vs．8．77~0．83％。p<0．05)，對(duì)壞死并無(wú)明顯影響(1．18±0．14％vs．1．25~0．28％，p>0．05)。乳酸脫氫酶活性測(cè)定顯示大黃素促進(jìn)VSMCs壞死，可被DPI輕微減輕。(3)大黃素干預(yù)后細(xì)胞出現(xiàn)非計(jì)劃性DNA合成(DNA損傷修復(fù)標(biāo)志)。DNA修復(fù)基因表達(dá)增強(qiáng)。p53蛋白表達(dá)也上調(diào)(251~g／ml大黃素

7、組較對(duì)照組高1．69倍，p<0．05)。透射電子顯微鏡顯示細(xì)胞核中異染色質(zhì)增多。DPI未影響大黃素的UDS現(xiàn)象。(4)激光共聚焦顯示大黃素能迅速滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，但在細(xì)胞內(nèi)的分布呈明顯的選擇性：絕大多數(shù)大黃素分布于細(xì)胞漿中，僅有少量分布于細(xì)胞核內(nèi)。(5)CYP抑制劑(ABT、a-NF)或者誘導(dǎo)劑(3一MC、p．NF)對(duì)大黃素抑制VSMCs增殖和促ROS生成效應(yīng)均無(wú)明顯影響。(6)大黃素呈濃度和時(shí)間依賴性促進(jìn)VSMCs老化。我們還觀察到大

8、黃素干預(yù)后VSMCs白噬的現(xiàn)象。 結(jié)論：(1)低濃度大黃素抑制VSMCs增殖，高濃度促進(jìn)VSMCs死亡。(2)ROS途徑和p53途徑是大黃素發(fā)揮效應(yīng)的兩個(gè)主要途徑，ROS是大黃素促細(xì)胞凋亡效應(yīng)的主要參與者，p53途徑主要參與抑制細(xì)胞增殖，也涉及細(xì)胞凋亡。(3)培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞中沒(méi)有CYP表達(dá)，大黃素自身發(fā)揮作用，而非代謝產(chǎn)物。 第二部分MTT法用于測(cè)定大黃素細(xì)胞毒性作用的效果 背景：MTT法被廣泛用于測(cè)定藥物的細(xì)

9、胞毒性作用，但其特異性和敏感性也可以受一些因素的影響，如有顏色物質(zhì)。我們將探索大黃素自身是否也是干擾因素。方法：血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)于M199培養(yǎng)液中。使用分光光度計(jì)測(cè)定大黃素和甲囋的吸光度(O.D.)。 結(jié)果：在不同溶劑中，大黃素具有不同的吸收光譜。溶劑中存在水分時(shí)吸收光譜將向右移，與甲囋的吸收光譜明顯重疊。大黃素呈濃度依賴性直接將MTT還原為甲囋，大黃素的還原能力可被血清顯著抑制。大黃素在細(xì)胞內(nèi)含量非常微弱且其代謝轉(zhuǎn)化非常緩慢