牛膝多糖脂質(zhì)體的免疫增強(qiáng)活性研究.pdf

1、牛膝，別名叫?？南?，其屬于莧科、牛膝屬。牛膝擁有滋補(bǔ)肝腎、散化惡血、破癥結(jié)、減緩腰膝酸疼功能。該論文研究的牛膝多糖(Achyranthes bidentata polysaccharides，ABPS)，提取自懷牛膝，ABPS是一種可溶于水小分子生物活性多糖，能夠提高機(jī)體的免疫力，抑制腫瘤生長及升高白細(xì)胞等。現(xiàn)今，牛膝多糖的化學(xué)構(gòu)造也早已得到研究，由果糖和葡萄糖構(gòu)成，糖基比8.7∶1.0，有4～21個(gè)糖單位，1400的平均分子質(zhì)量。與部

2、分其他多糖比較，牛膝多糖具有分子量小、水溶性好、藥源廣泛且既可口服又可注射的特點(diǎn)，作為醫(yī)藥開發(fā)應(yīng)用的前景更為廣闊。脂質(zhì)體(Lipsomes)是一種薄膜微球的藥物緩釋制劑，在脂質(zhì)雙分子層中包入藥物。脂質(zhì)體具有多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，例如，藥物毒性減弱，提高藥物的穩(wěn)定性，減少過敏反應(yīng)和免疫反應(yīng)，延遲藥物釋放，改變藥物的體內(nèi)分布、藥物靶向釋放。將牛膝多糖包封于脂質(zhì)體中，可提高牛膝多糖實(shí)際生產(chǎn)過程中和臨床上的利用度，并且為臨床使用提供一種可參考的劑型，同時(shí)也

3、為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。本論文中牛膝多糖脂質(zhì)體（Achyranthes bidentata polysaccharidesliposome，ABPSL）的制備方法選用薄膜分散法，然后采用響應(yīng)面法優(yōu)化了牛膝多糖脂質(zhì)體的最佳制備條件，并在體外研究了牛膝多糖脂質(zhì)體的免疫增強(qiáng)活性。試驗(yàn)分為以下四個(gè)部分:
　　試驗(yàn)Ⅰ牛膝多糖脂質(zhì)體的制備及制備條件的優(yōu)化本章經(jīng)薄膜分散法和逆向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體，并通過對比后，最終選用薄膜分散法制備ABPSL，而優(yōu)

4、選ABPSL制備的最佳條件采用響應(yīng)曲面法。用微柱離心法來分離脂質(zhì)體與未被包封的藥物，然后用5％苯酚-濃硫酸比色法測定ABPS的濃度，從而通過以上數(shù)值來計(jì)算脂質(zhì)體對藥物的包封率。以包封率和載藥量為指標(biāo)，分別考察了脂藥比、膜材比、磷脂-吐溫80比和超聲時(shí)間4個(gè)單因素，以優(yōu)選牛膝多糖脂質(zhì)體制備的最佳條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對影響包封率較大的三個(gè)因素，脂藥比、磷脂-吐溫80比和超聲時(shí)間采用響應(yīng)面法進(jìn)行研究。將數(shù)據(jù)通過專門軟件Design-E

5、xpert進(jìn)行分析，從而得到結(jié)論，當(dāng)脂藥比為26∶1，磷脂-吐溫80比為6∶1，超聲時(shí)間為14min時(shí)，為制備牛膝多糖脂質(zhì)體的最佳條件。根據(jù)最佳制備條件組合進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，所得脂質(zhì)體包封率為80.885±1.145％，與預(yù)測值79.90％的相對誤差僅為1.23％。
　　試驗(yàn)Ⅱ牛膝多糖脂質(zhì)體體外對小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響首先對ABPSL和ABPS進(jìn)行小鼠外周血淋巴細(xì)胞生長的最大安全濃度測定。ABPSL和ABPS由2mg·mL-1為起始

6、濃度倍比稀釋至11個(gè)濃度，將其分別加入分離好的細(xì)胞中，體外培養(yǎng)48 h后使用MTT法測定吸光值，并篩選出不顯著低于細(xì)胞對照組的為最大安全濃度;ABPSL、ABPS和BL取最大安全濃度以下的5個(gè)濃度，單獨(dú)或協(xié)同PHA，LPS加入小鼠外周血淋巴細(xì)胞中，外培養(yǎng)48 h后依然采用MTT法進(jìn)行測定，觀察ABPSL對脾淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖情況的影響。結(jié)果顯示，ABPSL在7.813～15.625ug·mL-1濃度范圍及濃度125 u

7、g·mL-1時(shí)，相比ABPS，更能促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖;ABPSL在15.625～62.5 ug·mL-1濃度范圍內(nèi)，相比ABPS，協(xié)同LPS促進(jìn)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖的效果更顯著;在7.813～125 ug·mL-1濃度范圍內(nèi)除了31.25μg·mL-1時(shí)， ABPSL相比ABPS，能更好地協(xié)同PHA促進(jìn)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖。
　　試驗(yàn)Ⅲ牛膝多糖脂質(zhì)體對小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響本章試驗(yàn)研究小鼠T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞在不同藥

8、物形態(tài)作用下的表達(dá)及比較分析。在制得的脾淋巴細(xì)胞懸液中加入一定濃度的ABPSL、ABPS和BL(31.25μg·mL-1)0.5mL，該濃度下重復(fù)三個(gè)孔，另設(shè)細(xì)胞對照孔，一定條件培養(yǎng)后加入CD3+，CD4+和CD8+混合抗體進(jìn)行標(biāo)記，采用雙染色標(biāo)記法標(biāo)記，然后用流式細(xì)胞儀測定T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+的含量變化。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，ABPSL組T淋巴細(xì)胞亞群CD8+細(xì)胞含量顯著低于ABPS組和BL組，而ABPSL組T淋巴細(xì)胞亞群CD

9、4+細(xì)胞含量以及CD4+/CD8+的比例均顯著高于ABPS組、BL組和BC組，表明其免疫效果優(yōu)于ABPS和BL。綜上可知ABPS經(jīng)脂質(zhì)體包封后，二者可協(xié)同作用以增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。
　　試驗(yàn)Ⅳ牛膝多糖脂質(zhì)體體外對巨噬細(xì)胞免疫功能的作用本章試驗(yàn)將就ABPSL對非特異性免疫力的影響做進(jìn)一步的探究，通過ABPSL對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的作用，以研究ABPSL對巨噬細(xì)胞活性及免疫功能的影響。結(jié)果顯示，ABPSL高濃度組刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-1