卡介菌多糖核酸免疫增強作用與安全性研究及其脂質(zhì)體的制備與評價.pdf

1、卡介菌多糖核酸（Bacillus Calmette Guerin polysaccharide nucleic acid，BCG-PSN）是一種新型免疫調(diào)節(jié)劑，具有提高T淋巴細胞免疫功能;激活T淋巴細胞，促進白細胞介素等分泌，從而產(chǎn)生多種免疫調(diào)節(jié)的淋巴因子;增強巨噬細胞功能，提高機體殺傷細菌、病毒能力;提高溶菌酶活力等眾多作用。經(jīng)臨床試驗證實，BCG-PSN目前已成為防治哮喘、慢性支氣管炎、風濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)性皮炎等病癥較為理想的藥物。

2、為進一步提高BCG-PSN的療效并減少其不良反應(yīng)，我們在本試驗中采用獨特的低溫細菌細胞破壁、熱酚提取法分離和提純BCG-PSN，并設(shè)計了適合本藥物的的薄膜蒸發(fā)法制備BCG-PSN脂質(zhì)體。同時為了提高藥物穩(wěn)定性，制備了BCG-PSN凍干脂質(zhì)體。在此基礎(chǔ)上，我們對BCG-PSN免疫增強作用及其安全性進行評價，為BCG-PSN在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用提供試驗和理論依據(jù)。
　　 1.BCG-PSN制備條件的優(yōu)化及其質(zhì)量控制為了優(yōu)化BCG-P

3、SN制備工藝，試驗采用超聲破碎卡介菌(BCG)的細胞壁，利用熱酚法除去菌體蛋白，以多糖核酸的含量為考察指標，選取苯酚濃度、熱酚次數(shù)、乙醇用量三個因素，每個因素三個水平，通過正交試驗L9(33)確定BCG-PSN的最佳提取工藝和條件。結(jié)果表明，對BCG-PSN提取量影響因素的大小依次是熱酚次數(shù)、苯酚濃度、乙醇用量，并且90％苯酚、熱酚處理次數(shù)為4次、濃縮液∶乙醇為1∶5時，所獲得的BCG-PSN含量最大(96.488％)，而且對上述最佳工

4、藝進行了重復性驗證，證實其具有良好的重現(xiàn)性。
　　 2.BCG-PSN與IBD疫苗聯(lián)合應(yīng)用對雞的免疫增強作用將0.6 mg·kg-1，0.3mg·kg-1，0.15 mg·kg-1，0.075 mg·kg-1和0.0375 mg·kg-1的BCG-PSN與IBD疫苗聯(lián)合應(yīng)用于人工感染IBDV的受試雛雞，通過測定免疫器官指數(shù)、IBD抗體滴度、外周血T淋巴細胞亞群、巨噬細胞吞噬活性、血清IFN-γ及IL-2濃度等免疫學指標，研究BC

5、G-PSN和IBD疫苗的免疫協(xié)同作用及其效果。研究結(jié)果表明，與單用IBD疫苗比較，高劑量BCG-PSN(0.6 mg·kg-1)能夠極顯著地升高脾臟和胸腺系數(shù)，中劑量(0.15mg·kg-1)、低劑量(0.075 mg·kg-1) BCG-PSN能極顯著延緩法氏囊退化;中劑量(0.15mg·kg-1)的BCG-PSN能夠明顯誘導IBD抗體的產(chǎn)生和提高CD4+/CD8+T淋巴細胞比值，維持CD4+和CD8+T淋巴細胞的平衡;BCG-PSN

6、顯著升高雞血清IFN-γ和IL-2含量，而且作用持續(xù)時間相對較長，尤其對IL-2的持續(xù)誘導效果更為明顯。說明與IBD疫苗聯(lián)合應(yīng)用，BCG-PSN能夠劑量相關(guān)性的促進雞機體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，同時增強機體體液免疫和細胞免疫作用;BCG-PSN對非特異性免疫沒有明顯影響。
　　 3.BCG-PSN安全性觀察BCG-PSN的靜脈刺激性、溶血及過敏反應(yīng)。以藥物最大溶解度為最高劑量，小鼠分別腹腔注射不同劑量的BCG-PSN，測定其急性毒性;小鼠

7、腹腔注射不同劑量的BCG-PSN，連續(xù)給藥14 d，觀察其亞慢性毒性;小鼠腹腔注射不同劑量的BCG-PSN，以小鼠骨髓微核扣精子畸形為指標，評價其致突變作用。結(jié)果表明，BCG-PSN無靜脈刺激性、溶血及過敏反應(yīng)。腹腔注射不同劑量的BCG-PSN，最高劑量2000 mg·kg-1·bw-1，連續(xù)觀察14d，小鼠僅出現(xiàn)輕微的中毒癥狀，未出現(xiàn)死亡，故小鼠腹腔注射BCG-PSN的最大給藥量為2000 mg·kg-1·bw-1;與正常對照組比較，

8、亞慢性毒性試驗小鼠在整個試驗周期內(nèi)反應(yīng)靈敏、活動正常且未出現(xiàn)死亡;BCG-PSN高、中劑量組小鼠進食量在前期顯著降低，高劑量組小鼠體重在試驗前期顯著下降;高劑量組脾臟指數(shù)顯著升高，高、中劑量組白細胞總數(shù)、紅細胞總數(shù)、血紅蛋白、紅細胞壓積和平均紅細胞容積顯著降低，尿素氮顯著升高，高劑量組白蛋白顯著降低。其他各項指標及病理組織學檢查結(jié)果與正常對照組沒有顯著性差異。小鼠致畸初步試驗結(jié)果表明，BCG-PSN對骨髓微核和精子畸形試驗結(jié)果均為陰性。

9、試驗證實，小鼠腹腔注射BCG-PSN的最大給藥量為2000 mg·kg-1·bw-1，長期大劑量應(yīng)用BCG-PSN可能引起貧血，無致突變作用。
　　 4.BCG-PSN脂質(zhì)體的制備根據(jù)水溶解性藥物的特點，本論文選用經(jīng)典的薄膜蒸發(fā)法制備BCG-PSN脂質(zhì)體（附圖），并采用星點設(shè)計-歸一化法優(yōu)化普通BCG-PSN脂質(zhì)體(FBL)的處方。在單因素考察的基礎(chǔ)上，確定三個自變量為BCG-PSN/卵磷脂（％，w/w）、膽固醇/卵磷脂(％，w

10、/w)以及BCG-PSN加入量(mg);因變量為包封率(％)、回收率(％)、粒徑與5000nm的差以及徑距。研究結(jié)果表明，以優(yōu)化處方制備樣品，各指標實測值與預測值偏差較小。
　　 5.BCG-PSN凍干脂質(zhì)體的制備及其穩(wěn)定性本試驗通過正交試驗得到最佳處方，確定BCG-PSN凍干脂質(zhì)體(PBL)的最佳參數(shù)。在此基礎(chǔ)上，對修飾前后BCG-PSN脂質(zhì)體的性質(zhì)及其在光照、分散介質(zhì)、模擬生物環(huán)境以及長期放置穩(wěn)定性進行了研究，并同時以BCG