載利福噴丁的BHA-PAA緩釋材料治療慢性骨髓炎研究.pdf

1、慢性骨髓炎主要由金葡球菌引起，其中以耐藥金葡球菌居多，是骨科常見疾病，盡管當(dāng)前的外科手術(shù)技術(shù)不斷改進(jìn)及抗生素藥物不斷更新，但是慢性骨髓炎的治療對(duì)骨科醫(yī)生來說，相當(dāng)棘手，給患者帶來了極大的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于病灶局部血運(yùn)的嚴(yán)重破壞，通過口服或靜脈長期應(yīng)用抗生素，血液很難將抗生素?cái)y帶到感染局部，達(dá)不到有效的殺菌濃度，使得感染殘留，復(fù)發(fā)率較高，而且增加了機(jī)體重要器官損害的毒副作用及耐藥性的產(chǎn)生。在慢性骨髓炎病灶清除時(shí)常留下不同程度的骨缺損，若

2、缺損過大，將影響骨干的力學(xué)強(qiáng)度及穩(wěn)定性，這需要植骨促進(jìn)骨缺損的愈合，恢復(fù)骨干的穩(wěn)定性。盡管采取了徹底的清創(chuàng)術(shù)，但是在骨缺損局部仍殘留一定數(shù)量的細(xì)菌，當(dāng)有植入物時(shí)，殘留的病原菌將大量繁殖，導(dǎo)致植骨失敗。因此，用于治療慢性骨髓炎的骨植入填充材料，必須既能根除感染局部殘留的細(xì)菌，又能填充支撐及重建骨缺損，是治愈慢性骨髓炎關(guān)鍵。上世紀(jì)七、八十年代Buchholz、Wahlig、Klemm等先后報(bào)道了用慶大霉素聯(lián)合骨水泥在治療骨感染中取得顯著療效

3、,局部應(yīng)用抗生素極大引起人們的關(guān)注。局部載藥緩釋系統(tǒng)直接向病變局部穩(wěn)定、持續(xù)地釋放抗生素，不需要血液將抗生素運(yùn)送至感染局部，在局部達(dá)到較高的藥物濃度，有效抑制及殺滅細(xì)菌，提高骨髓炎的治愈率，降低了復(fù)發(fā)率。同時(shí)血循環(huán)中較低藥濃度，避免系統(tǒng)用藥引起重要器官毒副作用。但PMMA骨水泥存在許多不足之處：（1）在聚合加工過程中產(chǎn)生大量的熱使部分抗生素失活，冷凝固后是硬質(zhì)，缺乏自然骨納米樣的空隙結(jié)構(gòu)，抗生素?zé)o法有效釋放；（2）植入體內(nèi)不能降解，需要

4、增加二次手術(shù)取出；同時(shí)無成骨作用，在骨髓炎控制后需要植骨重建骨缺損，這加重了病人的痛苦；（3）繼發(fā)感染。
　　隨著組織生物工程學(xué)發(fā)展及鍛造技術(shù)提高，出現(xiàn)許多生物相容性良好、可降解、誘導(dǎo)成骨可控緩釋材料替代了PMMA骨水泥，其中羥基磷灰石及其衍生物研究得最多。羥基磷灰石是構(gòu)成骨的主要成分，有良好的生物相容性和生物活性而廣泛應(yīng)用于骨組織的修復(fù)與替代材料。
　　本實(shí)驗(yàn)研究用重慶醫(yī)科大學(xué)與四川大學(xué)國納公司聯(lián)合生產(chǎn)類骨磷灰石/聚氨基酸

5、（bone-like hydroxyapatite/poly amino acid,BHA/PAA）為載抗生素微球載體，聯(lián)合用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA，50:50)包封利福噴?。≧IP）制成RIP微球（ RPM），治療慢性骨髓炎。BHA是碳酸化的納米羥基磷灰石（n-hydroxyapatite），與正常骨組織的結(jié)構(gòu)更相似，納米結(jié)晶小，生物相容性良好，降解吸收快，生物活性更

6、強(qiáng)。另外納米結(jié)晶比n-HA小，表觀面積增大，吸附容納藥物及藥物微球量增加。聚氨基酸（poly amino acid，PAA）結(jié)構(gòu)與膠原蛋白分子相似，具有良好生物相容性及降解性。BHA良好的生物相容性、誘導(dǎo)成骨性骨傳導(dǎo)性聯(lián)合PAA良好的韌性及機(jī)械可加工性，創(chuàng)造了一種有潛力的骨修復(fù)替代材料。
　　本課題用BHA/PAA作為PLGA包封RIP微球的載體，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行了載RMP的BHA/PAA復(fù)合材料的藥物釋放、抗菌能力、細(xì)胞毒性

7、、成骨誘導(dǎo)性及生物相容性的檢測(cè)及評(píng)估，為臨床治療慢性骨髓炎提供一種新的治療途徑。
　　目的:
　　體外實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)載利福噴丁微球的BHA/PAA復(fù)合骨材料藥物釋放、抑菌及抗菌能力、細(xì)胞毒性及對(duì)成骨樣 MG63細(xì)胞增殖與成骨情況的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，建立兔脛骨慢性骨髓炎動(dòng)物模型，同時(shí)在此基礎(chǔ)上，研究載利福噴丁微球的BHA/PAA作為骨填充材料治療慢性骨髓炎，通過抗菌能力、誘導(dǎo)成骨與骨缺損恢復(fù)情況、重要器官影響的評(píng)估

8、；通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)希望找到一種新的抗感染能力強(qiáng)又有誘導(dǎo)成骨能力的載抗生素緩釋復(fù)合骨材料，為科研與臨床治療慢性骨髓炎進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)及新的方法。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)由四部分組成
　　1.載利福噴丁微球類骨磷灰石/聚氨基酸復(fù)合人工骨材料體外藥物緩釋、抗菌能力及生物相容性的測(cè)定
　　通過體外抑菌環(huán)試驗(yàn)及掃描電鏡（SME）檢測(cè)載RMP的BHA/PAA復(fù)合人工骨材料對(duì)金葡球菌與大腸桿菌的抑菌及抗菌能力；采用MTT法

9、、急性溶血實(shí)驗(yàn)檢查該載藥復(fù)合骨材料的細(xì)胞生物相容性及安全性。2.載利福噴丁微球類骨磷灰石/聚氨基酸復(fù)合人工骨材料體外成骨能力的測(cè)定
　　以BHA/PAA為對(duì)照，通過倒置顯微鏡、電鏡掃描、MTT增殖實(shí)驗(yàn)、鈣含量與堿性磷酸酶ALP測(cè)定、茜紅素染色方法對(duì)成骨樣MG63細(xì)胞形態(tài)、粘附、增殖、成骨及理化特性等方面檢測(cè)載載 RMP的BHA/PAA復(fù)合人工骨材料對(duì)成骨樣MG63細(xì)胞的生長與成骨能力的影響。
　　3.慢性骨髓炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建

10、立與評(píng)估
　　通過兔右脛骨近端髓腔內(nèi)注射5％魚肝油酸鈉與金葡萄球菌懸液，同時(shí)留一半動(dòng)物髓腔內(nèi)填入異物棉球，誘導(dǎo)建立慢性骨髓炎。探討慢性骨髓炎嚴(yán)重程度與異物之間的關(guān)系，為研究建立慢性骨髓炎動(dòng)物模型提供一種理想合適的方法。
　　4.載利福噴丁微球類骨磷灰石/聚氨基酸復(fù)合人工骨材料治療兔脛骨慢性骨髓炎療效及重要器官毒副作用研究
　　慢性骨髓炎動(dòng)物模型成功建立后，經(jīng)徹底的病灶清創(chuàng)，分別植入載RMP的BHA/PAA復(fù)合人工骨材料

11、(A組，實(shí)驗(yàn)組)、未載藥BHA/PAA復(fù)合人工骨材料(B組，控制對(duì)照組)，空白對(duì)照組(C組，未植入任何材料)，通過大體觀察、放射學(xué)、組織病理學(xué)、細(xì)菌微生物學(xué)檢測(cè)復(fù)合人工骨材料抗菌效果；通過放射學(xué)、組織病理學(xué)、掃描電鏡、鈣黃綠素?zé)晒鈽?biāo)記共聚焦電鏡掃描檢測(cè)人工骨材料成骨誘導(dǎo)能力；通過肝腎功能與心、肝、肺及腎結(jié)構(gòu)變化組織病理學(xué)檢測(cè)，了解載藥材料在對(duì)動(dòng)物重要器官有無毒副作用。
　　結(jié)果:
　　1.載利福噴丁微球類骨磷灰石/聚氨基酸復(fù)

12、合人工骨材料體外藥物釋、抗菌能力及生物相容性的測(cè)定
　　載RPM的BHA/PAA復(fù)合人工骨材料體外對(duì)金葡球菌與大腸桿菌有明顯抑菌及抗菌作用，緩釋效果良好，特別是對(duì)金葡球菌抗菌能力更強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間更長；體外實(shí)驗(yàn)該材料對(duì)L929細(xì)胞和紅細(xì)胞無毒性作用，生物相容性良好。
　　2.載利福噴丁微球類骨磷灰石/聚氨基酸復(fù)合人工骨材料體外成骨能力測(cè)定
　　成骨樣MG63細(xì)胞與BHA/PAA及載RPM的BHA/PAA復(fù)合人工骨材料共培養(yǎng)

13、，在倒置顯微鏡觀察，見成骨樣 MG63細(xì)胞在復(fù)合人工骨材料周圍粘附、生長良好，隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)量增多；培養(yǎng)7d后，通過SME觀察成骨樣MG63細(xì)胞在材料上粘附、生長狀況良好，并見大量鈣結(jié)節(jié)形成；MTT增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：各組細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加， MTT值各材料組與對(duì)照組之間有差異(P＜0.05)；成骨樣MG63細(xì)胞在不同材料上與空白對(duì)照組中培養(yǎng)的ALP活性與細(xì)胞鈣離子含量結(jié)果測(cè)定顯示：兩者都隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，檢

14、測(cè)結(jié)果顯示，各材料組與對(duì)照組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)上分析，有差異(P＜0.05)。
　　3.慢性骨髓炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立與評(píng)估
　　A組，注入0.2ml3×108CFU/ml細(xì)菌懸液；B組，注入0.2ml3×108CFU/ml細(xì)菌懸液，同時(shí)填入直徑0.4㎝異物棉球；C組，空白對(duì)照組，注入0.2ml生理鹽水。建模4w后，影像學(xué)檢查，除了空白對(duì)照組兔脛骨近端結(jié)構(gòu)恢復(fù)形態(tài)正常，其他兩組均顯示程度不同骨小梁纖細(xì)、稀疏，骨密度降低，骨溶解，死骨形

15、成；HE染色組織病理學(xué)檢測(cè)從骨膜到髓腔均顯示程度不同的炎癥細(xì)胞浸潤，骨髓腔內(nèi)細(xì)胞壞死，間質(zhì)出血；采用大體標(biāo)本觀察和放射學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)金葡球菌骨髓炎動(dòng)物模型進(jìn)行嚴(yán)重程度分級(jí)：空白對(duì)照組屬0級(jí)，A組屬2~3級(jí)，B組屬3~4級(jí)。
　　4.載利福噴丁微球類骨磷灰石/聚氨基酸復(fù)合人工骨材料治療慢性骨髓炎療效及對(duì)重要器官毒副作用研究
　　4.1載利福噴丁微球類骨磷灰石/聚氨基酸復(fù)合人工骨材料治療慢性骨髓炎療效的研究
　　抗菌能力：慢

16、性骨髓炎清創(chuàng)術(shù)后治療12w，大體標(biāo)本觀察見A組脛骨近端形態(tài)恢復(fù)正常，無骨破壞、骨壞死及膿性分泌物；B、C其兩組脛骨近端形態(tài)變形、增寬，骨質(zhì)破壞嚴(yán)重，缺損處見大量膿性分泌物；清創(chuàng)及術(shù)后治療4w，病灶骨組織細(xì)菌培養(yǎng)，計(jì)算每克骨標(biāo)本的細(xì)菌菌落數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：A組細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)明顯小于B、C組，有非常明顯的差異（P＜0.01)，B組與C組比較無顯著性差異(P＞0.05)；清創(chuàng)及術(shù)后治療12w，HE染色組織病理學(xué)檢查顯示，A組無炎癥反應(yīng)，

17、未見炎癥細(xì)胞，而B、C兩組炎癥細(xì)胞明顯可見。
　　成骨能力：清創(chuàng)及術(shù)后治療12w，大體觀察、組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)、SME及熒光標(biāo)記檢查評(píng)價(jià)載RPM-BHA/PAA復(fù)合人工骨誘導(dǎo)成骨效果。大體標(biāo)本觀察，A組脛骨近端形態(tài)恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)，材料被新骨完全覆蓋，未見材料，骨缺損恢復(fù)；B、C其兩組脛骨近端形態(tài)變形、增寬，骨破壞嚴(yán)重，骨缺損邊緣見不同程度增生及硬化，骨壞死明顯可見；B組材料明顯可見，材料上及其周圍無新骨形成。HE染色病理學(xué)檢查

18、，A組明顯軟骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)及新的骨小梁形成，材料大部分降解吸收；B、C兩組無新骨形成，B組材料明顯可見。熒光標(biāo)記檢測(cè)，A組材料內(nèi)見大量綠色熒光，B、C組僅見少量、散在、模糊熒光點(diǎn)。Ⅰ型膠原纖維抗體標(biāo)記膠原纖維免疫組織學(xué)檢查顯示：A組見膠原纖維大量形成，呈編織樣，圍繞材料周圍，成骨活動(dòng)明顯；B組無膠原纖維或少量膠原纖維形成；C無膠原纖維形成形成。SME檢測(cè)結(jié)果顯示，A組，材料內(nèi)骨小梁晶體形成，呈放射狀向材料內(nèi)生長，材料降解吸收明顯，材料

19、被新骨覆蓋，骨缺損恢復(fù)，新骨與宿主骨緊密連接；B組，材料內(nèi)骨小梁形成不明顯，僅見少量、散在骨小梁晶體形成，材料無明顯降解吸收。
　　4.2載利福噴丁微球類骨磷灰石/聚氨基酸復(fù)合人工骨材料動(dòng)物體內(nèi)重要器官毒副作用的研究
　　不同時(shí)間點(diǎn)血肝腎功能生化檢測(cè)結(jié)果顯示：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）檢測(cè)值在不同組間同一時(shí)間點(diǎn)及同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)，載藥實(shí)驗(yàn)組與未載藥組、空白對(duì)照組

20、之間比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無顯著性（P＞0.05）。HE染色病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的心、肝、肺及腎結(jié)構(gòu)正常，無差異。
　　結(jié)論:
　　1.載利福噴丁微球類骨磷灰石/聚氨基酸復(fù)合人工骨材料體外對(duì)金色葡球菌和大腸桿菌有明顯抑菌及抗菌作用，尤其對(duì)金葡萄球菌，且抗菌能力隨利福噴丁劑量的增加而增加；體外毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)L929細(xì)胞和紅細(xì)胞無毒性，不產(chǎn)生機(jī)械損傷，生物相容性良好。
　　2.載利福噴丁微球類骨磷灰石/聚氨基酸復(fù)合人

21、工骨材料體外實(shí)驗(yàn)對(duì)成骨樣MG63細(xì)胞生長無抑制作用，而且具有促進(jìn)成骨樣MG63細(xì)胞的粘附、生長、增殖、成熟及鈣結(jié)節(jié)的形成；對(duì)成骨樣 MG63細(xì)胞的鈣離子含量及堿性磷酸酶活性（ALP）均無影響，而且促進(jìn)其分泌；對(duì)成骨樣MG63細(xì)胞有良好的生物相容性。
　　3.載利福噴丁微球類骨磷灰石/聚氨基酸復(fù)合人工骨材料是具有良好的抗菌和成骨誘導(dǎo)能力的骨緩釋材料；短時(shí)間內(nèi)對(duì)兔重要器官無明顯毒副作用；在慢性骨髓炎徹底病灶清除后，能一期填如支撐骨缺損