靶點灌注臭氧治療慢性骨髓炎的實驗研究.pdf

1、慢性骨髓炎一直是醫(yī)學(xué)界公認的頑疾之一，被喻為“第二癌癥”。盡管新一代抗菌藥物抗菌活性不斷提升，手術(shù)干預(yù)手段日趨完善，但慢性骨髓炎的復(fù)發(fā)率仍高達20-30％[1]，部分傷員最終不得不行截肢術(shù)，不僅給患者個人帶來巨大的身心痛苦，而且給家庭及國家?guī)沓林氐慕?jīng)濟負擔[1,2,3]。因此，縮短慢性骨髓炎的治療時間，提高治愈率，降低致殘率，具有重大的臨床意義和社會意義。
　　 當前治療慢性骨髓炎所形成的共識是:徹底清創(chuàng)和傷口引流的基礎(chǔ)上給予

2、抗菌藥物治療[3]。抗菌藥物貫穿于慢性骨髓炎的治療過程并決定著治療的成敗。近年來，雖然抗菌新藥不斷推出、給藥方式不斷改進，但治療效果并不十分理想[4]。病灶內(nèi)游離態(tài)抗菌藥物濃度不足導(dǎo)致治愈率低和復(fù)發(fā)率高等問題始終未能徹底解決。臭氧是一種強氧化劑，具有廣譜高效殺菌作用，近年來的實驗研究表明，適當濃度的臭氧還具有殺滅細菌生物膜、調(diào)節(jié)機體氧化應(yīng)激、改善組織微循環(huán)等作用。本課題首先建立靶點灌注臭氧治療兔脛骨慢性骨髓炎模型，利用微透析取樣技術(shù)對靶

3、組織抗菌藥物—萬古霉素的藥代動力學(xué)進行研究，探討臭氧與抗菌藥物的協(xié)同作用關(guān)系;其次，通過測定靶組織IL-6、TNF-α的含量，并通過影像學(xué)、病理學(xué)和微生物學(xué)手段評估療效，摸索出臭氧局部治療的有效方案。通過本實驗研究，我們試圖闡明局部應(yīng)用臭氧治療慢性骨髓炎的內(nèi)在作用機制，從而為慢性骨髓炎的治療開辟新思路與新途徑。
　　 一、目的:
　　 建立兔慢性骨髓炎模型，靜脈給予鹽酸萬古霉素，并在骨組織局部灌注臭氧，采用微透析技術(shù)聯(lián)合

4、反相高效液相色譜(HPLC)同步測定鹽酸萬古霉素在兔骨組織和血液中規(guī)定時間點的游離藥物濃度，觀察鹽酸萬古霉素在骨組織和血液的藥代動力學(xué)變化特點，探討臭氧與抗菌藥物的協(xié)同作用關(guān)系;其次，定量分析骨髓炎病灶部位炎癥因子（IL-6、TNF-α）的變化與臭氧的關(guān)系，初步揭示臭氧抗感染治療的機制，為臭氧聯(lián)合萬古霉素治療慢性骨髓炎提供依據(jù)。
　　 二、材料和方法:
　　 1、萬古霉素的藥動學(xué)研究部分:雄性新西蘭大白兔18只，體重2-

5、2.5Kg，隨機分為3組，分別為正常組，慢性骨髓炎萬古霉素治療組，臭氧聯(lián)合萬古霉素治療組。實驗前18小時禁食不禁水。三個實驗組均經(jīng)兔耳緣靜脈給予鹽酸萬古霉素30mg/Kg，臭氧干預(yù)組在靜注萬古霉素前給予臭氧2ml(40μ g/mL)，采用微透析技術(shù)對骨組織和血液進行同步取樣，聯(lián)合反相高效液相色譜技術(shù)實時檢測骨組織和血液中鹽酸萬古霉素的濃度變化，所得藥物濃度數(shù)據(jù)用WinNonlin軟件處理。
　　 2、臭氧抗感染治療的機制研究:雄

6、性新西蘭大白兔18只，體重2-2.5Kg，隨機分為3組，分別為正常組，慢性骨髓炎對照組，慢性骨髓炎臭氧干預(yù)組。臭氧干預(yù)組給予臭氧2ml(40μ g/mL)，采用微透析技術(shù)對骨組織進行取樣，聯(lián)合ELISA法對樣品中的IL-6、TNF-α進行定量分析。
　　 三、結(jié)果:
　　 1、藥代動力學(xué)研究:正常兔血液中的游離萬古霉素濃度在靜注后10min達峰，為41.5±2.71μg/ml，骨組織也在10min時到達峰濃度40.57±

7、2.50μg/ml，兩者濃度在100min前始終保持接近;100min后，血液中的藥物濃度開始高于骨組織，并持續(xù)至觀察點結(jié)束。慢性骨髓炎組病灶部位骨組織中的萬古霉素含量較血液明顯降低，10min達峰濃度分別43.31±2.67μg/ml（血液），16.35±1.67μg/ml（骨）。臭氧干預(yù)治療后，病灶骨組織的萬古霉素濃度明顯提高，達到44.37±2.31μg/ml（血液），20.58±4.85μg/ml（骨），但仍低于正常骨組織的藥物

8、濃度。血液、骨組織的藥時曲線下面積AUC0-inf在三個實驗組分別為:正常組:5280.31±205.73min*μg/ml（血液）和5065.03±209.56min*μg/ml（骨）;慢性骨髓炎萬古霉素治療組:5106.45±205.73min*μg/ml（血液）和1259.53±48.42min*μg/ml（骨）;臭氧聯(lián)合萬古霉素治療組:5353.51±325.58min*μg/ml（血液）和1873.43±573.7min*μg

9、/ml（骨）。
　　 2、炎癥因子變化研究:IL-6、TNF-α在臭氧灌注后均明顯下降，在慢性骨髓炎組，病灶部位IL-6和TNF-α的含量分別為:318.1±2.82pg/ml-361.42±8.52pg/ml，231.48±14.89pg/ml-267.13 pg/ml;臭氧干預(yù)組病灶部位和正常組骨組織的含量分別為79.60±10.12pg/ml-277.16±10.02 pg/ml,59.37±10.57pg/ml-112.

10、06±14.85pg/ml(TNF-α);127.36±13.83pg/ml-371.69±11.97pg/ml,91.91±10.57pg/ml-227.27±17.75pg/ml(IL-6)。
　　 四、結(jié)論:
　　 微透析采樣技術(shù)具有良好的時間和空間分辨性，聯(lián)合反相高效液相色譜檢測方法可以準確客觀地反映藥物在慢性骨髓炎病灶組織和血液中的藥代動力學(xué)特點，是進行藥動學(xué)研究的良好工具。實驗證明，靜脈給藥時鹽酸萬古霉素具有

11、良好的骨組織穿透性。與血漿藥動學(xué)參數(shù)相比，正常骨組織的達峰濃度及達峰時間無差別，但在慢性骨髓炎病灶部位，骨組織中的游離態(tài)藥物濃度顯著低于血漿藥物濃度。臭氧干預(yù)后病灶組織的藥物峰濃度和最低濃度較單純應(yīng)用萬古霉素有所提高，顯示臭氧與萬古霉素間具有協(xié)同作用，該現(xiàn)象可能通過臭氧促進糖酵解酶類合成，加快糖代謝，增加NO、CO等物質(zhì)生成，擴張微血管，改善局部循環(huán)完成。進一步研究顯示臭氧可以調(diào)節(jié)炎癥因子的表達，顯著降低IL-6、TNF-α等炎癥因子的

12、表達水平，結(jié)合國內(nèi)外研究，臭氧可通過引起α-synuclein蛋白在細胞內(nèi)積聚，抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB的活性，使之不能進入細胞核內(nèi)，抑制細胞表達IL-10、IL-6、TNF-α等炎癥因子。雖然臭氧的協(xié)同作用無法將萬古霉素的骨組織含量提高到正常水平，但可延長萬古霉素在骨組織的駐留時間，這對于時間依賴性的抗菌藥物具有重要意義。同時臭氧的應(yīng)用可減輕局部慢性炎癥的反復(fù)刺激，有利于炎癥消除，并可抑制破骨細胞的活性，有利于骨組織重建。綜上所述，病