抑癌基因PDCD4在動脈粥樣硬化中的作用及其機制研究.pdf

1、研究目的
　　 動脈粥樣硬化癥是脂質(zhì)代謝異常導(dǎo)致的動脈血管壁的慢性炎癥性疾病，是心絞痛、急性心肌梗死或猝死等急性冠狀動脈綜合征的主要病理基礎(chǔ)，已經(jīng)成為嚴重影響我國中老年人健康的常見疾病，并有逐年遞增的趨勢。盡管動脈粥樣硬化的發(fā)病機制尚不清楚，但是最近幾年來有關(guān)“動脈粥樣硬化是動脈血管壁慢性炎性疾病”的炎癥學(xué)說得到了大家的認可，積累的證據(jù)顯示許多炎癥因子和免疫細胞參與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，即動脈粥樣硬化的發(fā)生是血管壁細胞與血液

2、細胞在多種炎癥因子和致病因子作用下相互作用所導(dǎo)致的一種血管損傷過程。在這一過程中，單核/巨噬細胞介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)和T細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)均發(fā)揮重要作用。
　　 抑癌基因是一類控制細胞過度增殖并遏制腫瘤形成的基因。近年來發(fā)現(xiàn)，很多抑癌基因例如P53，PTEN等不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，而且參與了免疫反應(yīng)和炎性疾病等生理和病理過程。程序性細胞死亡-4(programmedcelldeath4，PDCD4)是新確定的一種抑

3、癌基因，在人多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的抑制作用，但在炎性疾病中的作用尚不明確。有限的幾篇報道顯示PDCD4基因敲除(Pdcd4-/-)小鼠可抵抗自身免疫性疾病——實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)和Ⅰ型糖尿病的發(fā)生及脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的內(nèi)毒素性休克，提示PDCD4不僅具有抑癌基因的作用，很可能在炎癥性疾病中也發(fā)揮重要作用。那么，PDCD4是否在動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮作用呢？發(fā)揮何種作用？其作用機制是什么？目前尚不清楚。<

4、br>　　 為了明確PDCD4在動脈粥樣硬化中的作用，探索其作用機制，為動脈粥樣硬化的臨床治療提供理論證據(jù)和實驗基礎(chǔ)，本論文從以下兩個方面進行了研究:一、PDCD4在動脈粥樣硬化形成過程中的表達及作用:我們發(fā)現(xiàn)隨著Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊的進展PDCD4在斑塊局部的表達逐漸升高，提示PDCD4參與動脈粥樣硬化的發(fā)生。進一步采用雙基因敲除（Pdcd4-/-Apoe-/-）小鼠證明PDCD4的缺失明顯減少斑塊的形成，說明內(nèi)源性P

5、DCD4在動脈粥樣硬化中發(fā)揮促進作用。并且發(fā)現(xiàn)PDCD4的缺失影響了T細胞和巨噬細胞在斑塊局部的浸潤。二、PDCD4對免疫細胞的影響及其在動脈粥樣硬化中的作用:首先通過骨髓移植實驗證明免疫細胞在PDCD4影響動脈粥樣硬化的過程中發(fā)揮重要作用。然后體內(nèi)外試驗比較Pdcd4-/-Apoe-/-與Apoe-/-小鼠斑塊局部及外周的巨噬細胞和T淋巴細胞及其各亞群的比例，并檢測了其分泌細胞因子的改變。我們發(fā)現(xiàn)PDCD4的缺失顯著升高了IL-10的

6、水平，進一步體內(nèi)實驗證實PDCD4缺失導(dǎo)致的IL-10的升高是斑塊減少的一個重要原因。最后我們用RIP實驗確定了PDCD4不是通過直接與IL-10mRNA結(jié)合從而在翻譯水平抑制其表達，而是通過ERK和P38通路在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控IL-10的表達。
　　 研究方法
　　 一、PDCD4在動脈粥樣硬化形成過程中的表達及作用
　　 1.PDCD4在動脈粥樣硬化形成過程中的表達
　　 (1)用Westernblot的

7、方法檢測8周齡未高脂、高脂8周（16周齡）和高脂16周（24周齡）的Apoe-/-小鼠血管斑塊局部蛋白中PDCD4的表達情況。
　　 (2)用免疫組化的方法對斑塊局部PDCD4的表達進行細胞定位。
　　 2.PDCD4在動脈粥樣硬化形成中的作用
　　 (1)將Pdcd4-/-小鼠與Apoe-/-小鼠雜交獲得雙基因敲除小鼠(Pdcd4-/-Apoe-/-)做為實驗組，Apoe-/-小鼠做為對照組，給予高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)斑

8、塊的形成。
　　 (2)高脂喂養(yǎng)8周或16周后，取主動脈根制備冰凍切片，HE、油紅O染色及免疫組織化學(xué)染色比較Pdcd4-/-Apoe-/-和Apoe-/-小鼠主動脈根部斑塊大小、脂質(zhì)沉積、組成成分（平滑肌和膠原）及炎性浸潤（T細胞和巨噬細胞）的差別;取主動脈弓及胸腹主動脈，經(jīng)油紅O染色后，解剖顯微鏡下觀察并比較大體解剖斑塊數(shù)量和面積的差別。
　　 二、PDCD4對免疫細胞的影響及其在動脈粥樣硬化中的作用:
　　

9、 1.骨髓移植實驗證明免疫細胞在PDCD4缺失導(dǎo)致動脈粥樣硬化減弱過程中發(fā)揮主要作用
　　 (1)分別收集Pdcd4-/-和C57BL/6小鼠股骨和脛骨中骨髓細胞，通過尾靜脈注射移植入受致死劑量X射線照射的Ldlr-/-小鼠體內(nèi)，高脂喂養(yǎng)12周和16周后，分別處死小鼠，主動脈根部制備冰凍切片，HE和油紅O染色觀察并比較斑塊的大小。
　　 (2)冰凍切片進行免疫組化染色比較巨噬細胞和T細胞在斑塊局部的浸潤情況。
　　

10、 (3)Westernblot的方法檢測骨髓移植后高脂喂養(yǎng)2周、12周和16周的Ldlr-/-小鼠血管斑塊中PDCD4的表達。
　　 2.體內(nèi)實驗研究PDCD4缺失對巨噬細胞和T細胞亞群的影響
　　 (1)Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠和Apoe-/-小鼠高脂喂養(yǎng)8周或16周后，研磨小鼠脾臟，制備脾細胞的單細胞懸液，用流式細胞術(shù)的方法檢測并比較巨噬細胞和T細胞各亞群(CD4+，CD8+，Th17，Treg)比例的變

11、化，并用直線回歸的方法分析其比例與斑塊面積大小的相關(guān)性。
　　 (2)冰凍切片免疫熒光或免疫組化染色比較斑塊局部CD4+和CD8+比例的變化。
　　 3.體內(nèi)實驗研究PDCD4缺失對巨噬細胞和T細胞相關(guān)細胞因子的影響
　　 (1)血清中:流式細胞微球芯片試劑盒和ELISA的方法檢測并比較Pdcd4-/-Apoe-/-和Apoe-/-小鼠高脂喂養(yǎng)后血清中細胞因子(IL-2，IL-4，IL-6，IFN-γ，TNF-α

12、，IL-17，IL-10，TGF-β）的改變，并用直線回歸的方法分析細胞因子濃度與斑塊面積大小之間的相關(guān)性。
　　 (2)斑塊局部:
　　 1)冰凍切片免疫雙熒光染色比較斑塊局部IL-17和IL-10水平的變化。
　　 2)將含有大量斑塊的主動脈弓及胸腹主動脈血管組織裂解提取RNA或蛋白，分別用realtimePCR或Westernblot的方法檢測并比較斑塊局部細胞因子的改變。
　　 4.體外實驗研究P

13、DCD4對T細胞功能的影響及其機制
　　 (1)對T細胞增殖能力的影響:
　　 1)體外培養(yǎng)脾細胞并刺激活化，CCK8試劑盒檢測并比較實驗組與對照組的增殖情況。
　　 2)流式細胞儀檢測CD4+和CD8+T細胞的增殖情況。
　　 3)流式細胞儀分別檢測CD4+和CD8+T細胞中協(xié)同刺激分子CD28、CD137和協(xié)同抑制分子CTLA-4比例的變化。
　　 (2)對T細胞分泌細胞因子的影響:流式細胞微

14、球芯片試劑盒檢測并比較培養(yǎng)上清中細胞因子的改變。
　　 5.體外實驗研究PDCD4對巨噬細胞功能的影響:收集Pdcd4-/-和C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞進行體外培養(yǎng)，并用氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激不同的時間段使其活化，ELISA的方法檢測并比較培養(yǎng)上清中促炎性細胞因子IL-6、TNF-α和抑炎性細胞因子IL-10的濃度。
　　 6.體內(nèi)干預(yù)治療確定IL-17和IL-10在PDCD4缺失減弱動脈粥樣硬化斑塊形成

15、過程中的作用:以Apoe-/-小鼠做正常對照，將Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠分為三組，高脂喂養(yǎng)4周后分別給予生理鹽水、重組IL-17細胞因子和IL-10中和性抗體腹腔注射一周一次，共注射5周，處死小鼠，主動脈根部制備冰凍切片，HE和油紅O染色觀察并比較斑塊的大小。
　　 7.分子機制研究探討PDCD4從翻譯水平還是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控IL-10的表達
　　 (1)RNA蛋白結(jié)合免疫沉淀試劑盒(RIP)獲得與PDCD4結(jié)合的

16、全部RNA，realtimePCR擴增IL-10，確定PDCD4是否與IL-10mRNA形成復(fù)合體從而確定PDCD4是否從翻譯水平調(diào)控IL-10的表達。
　　 (2)提取活化巨噬細胞的總RNA，用RT-PCR的方法檢測并比較IL-10在mRNA水平的表達。
　　 (3)提取活化巨噬細胞的蛋白，用Westernblot的方法檢測并比較MAPK(JNK,ERK1/2，P38)信號通路的活化情況，并通過加入信號通路抑制劑后EL

17、ISA檢測上清中IL-10的表達情況確定PDCD4通過哪條信號傳導(dǎo)通路調(diào)控IL-10的轉(zhuǎn)錄。
　　 結(jié)果
　　 一、PDCD4在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中的表達與作用
　　 1.動脈粥樣硬化小鼠模型的建立
　　 我們給予8周齡的Apoe-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)，造成體內(nèi)高血脂壞境，誘導(dǎo)斑塊的形成。分別取8周齡（未高脂）做為無斑塊期，16周齡（高脂8周）做為早期斑塊期和24周齡（高脂16周）做為晚期斑塊期。<

18、br>　　 2.PDCD4在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中的表達
　　 為了明確PDCD4在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中的表達情況，我們分離16周和24周Apoe-/-小鼠富含斑塊的主動脈弓及胸腹主動脈裂解蛋白，以8周齡無斑塊血管為對照，westernblot的方法檢測了PDCD4的表達情況，結(jié)果顯示隨著高脂喂養(yǎng)時間的延長（即動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展）PDCD4的表達明顯升高。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)PDCD4主要表達于免疫細胞（巨噬細胞和T細胞

19、），另外，在平滑肌細胞中也有表達，提示PDCD4可能具有促進動脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展的作用。
　　 3.PDCD4在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中的作用
　　 為了研究PDCD4在動脈粥樣硬化形成過程中的作用，我們制各了Pdcd4和Aope雙基因敲除(Pdcd4-/-Apoe-/-)小鼠，并以此小鼠為實驗組，以Apoe-/-小鼠為對照組，研究了PDCD4缺失對動脈粥樣硬化形成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)8周或16周后Pdcd4

20、-/-Apoe-/-小鼠主動脈根部的斑塊和主動脈弓及胸腹主動脈段的斑塊較對照組相比，面積均明顯減小(p＜0.01)，脂質(zhì)沉積減少(p＜0.01)，局部巨噬細胞和T細胞的浸潤都較對照組明顯減少(p＜0.05)。另外，膠原含量、平滑肌細胞也明顯減少(p＜0.01)。以上結(jié)果說明PDCD4缺失使動脈粥樣硬化斑塊減小，即PDCD4本身起促進動脈粥樣硬化斑塊的作用。
　　 二、PDCD4對免疫細胞功能的影響及其在動脈粥樣硬化中的作用:

21、r>　　 1.骨髓移植實驗證明免疫細胞在PDCD4缺失導(dǎo)致動脈粥樣硬化減弱的過程中發(fā)揮主要作用
　　 已知免疫細胞在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而且PDCD4在斑塊局部浸潤的巨噬細胞和T細胞中高表達，PDCD4缺失的小鼠斑塊局部巨噬細胞和T細胞浸潤減少，提示PDCD4可能通過改變免疫細胞的功能發(fā)揮作用，故我們進一步利用骨髓移植的方法論證這個問題。我們將C57BL/6(含有野生型PDCD4)和Pdcd4-/-（缺失P

22、DCD4）小鼠的骨髓細胞移植給Ldlr-/-小鼠，并通過高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)斑塊的形成。然后取主動脈根制備冰凍切片進行HE和油紅O染色，比較斑塊面積的大小，發(fā)現(xiàn)移植Pdcd4-/-骨髓細胞的Ldlr-/-小鼠斑塊面積明顯比移植C57BL/6骨髓細胞的斑塊減小(p＜0.05)。將主動脈弓和胸腹主動脈段在解剖顯微鏡下剖開，油紅O染色，發(fā)現(xiàn)移植Pdcd4-/-骨髓細胞的Ldlr-/-小鼠大體解剖斑塊面積明顯比移植C57BL/6骨髓細胞的斑塊數(shù)量減少，

23、面積減小(p＜0.01)。同時發(fā)現(xiàn)移植Pdcd4-/-骨髓細胞的Ldlr-/-小鼠巨噬細胞和T細胞的浸潤較對照組明顯減輕。我們還用westernblot的方法檢測了移植后小鼠血管斑塊中PDCD4的表達，發(fā)現(xiàn)移植Pdcd4-/-骨髓細胞的Ldlr-/-小鼠斑塊中PDCD4表達較弱，明顯比對照組減少，所以我們認為斑塊中PDCD4雖在平滑肌細胞中有所表達，但其主要表達于免疫細胞中。以上結(jié)果雖不能排除平滑肌細胞的作用，但可證明免疫細胞在PDCD

24、4缺失減弱動脈粥樣硬化發(fā)生的過程中發(fā)揮著主要作用。
　　 2.體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)PDCD4缺失導(dǎo)致CD8+T細胞降低而Treg升高
　　 為了進一步研究PDCD4對免疫細胞的影響，我們用流式細胞儀檢測了外周免疫器官——脾臟中巨噬細胞(F4/80+)和T細胞各亞群(CD4+，CD8+，Treg)數(shù)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCD4缺失后小鼠脾臟巨噬細胞比例無明顯差別，但是CD8+T細胞比例在高脂喂養(yǎng)8周和16周后Pdcd4-/-Apo

25、e-/-小鼠較對照組都明顯降低(p＜0.01)，CD4+T細胞比例呈降低趨勢，其中CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)比例明顯上升(p＜0.01)，而效應(yīng)性Th1、Th2和Th17細胞無明顯變化。直線回歸分析顯示CD8+T細胞數(shù)量與斑塊面積呈正相關(guān)，而Treg數(shù)量與斑塊面積呈負相關(guān)關(guān)系。進一步斑塊局部免疫細胞化學(xué)染色證明Pdcd4-/-Aope-/-小鼠斑塊局部CD8+T細胞數(shù)量占斑塊面積的比例較對照組明顯減少(p＜0.01)，

26、而Treg(Foxp3+)細胞數(shù)量占斑塊面積的比例則比對照組明顯升高(p＜0.05)，變化趨勢與外周一致。已知CD8+T細胞在動脈粥樣硬化的形成過程中起促進作用，而Treg起抑制作用，我們的結(jié)果說明PDCD4缺失導(dǎo)致的CD8+T細胞降低和Treg升高可能是斑塊減少的原因之一。
　　 3.體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)PDCD4缺失導(dǎo)致抑炎性細胞因子IL-10增加而促炎性細胞因子IL-17下降
　　 為了研究PDCD4對外周巨噬細胞和T細胞

27、相關(guān)細胞因子的影響，我們?nèi)「咧桂B(yǎng)16周的Pdcd4-/-Apoe-/-和Apoe-/-小鼠血清，流式細胞微球芯片試劑盒和ELISA的方法分析了多種細胞因子（IL-2，IL-4，IL-6，IFN-γ，TNF-α，IL-17，IL-10和TGF-β）的變化，結(jié)果顯示Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠血清中IL-10、IL-6和IFN-γ濃度較對照組升高(p＜0.05)，而IL-17和TGF-β濃度較對照組降低(p＜0.05)，其他細胞因子

28、無明顯改變。為了確定細胞因子的變化與斑塊減小的關(guān)系，我們進行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)促炎性細胞因子IL-17的濃度與斑塊面積呈正相關(guān)，而抑炎性細胞因子IL-10濃度與斑塊的面積呈負相關(guān)關(guān)系，而IL-6、IFN-γ和TGF-β的濃度與斑塊的大小沒有明顯的相關(guān)關(guān)系。
　　 為了進一步確定PDCD4缺失對細胞因子的影響及與斑塊形成的關(guān)系，我們采用realtimePCR、Westernblot、免疫組織化學(xué)和免疫熒光等方法檢測了斑塊局部細胞因

29、子的改變，發(fā)現(xiàn)IL-17和IL-10的表達與外周趨勢一致，Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠斑塊局部IL-17明顯低于對照組(p＜0.05)，而IL-10明顯高于對照組(p＜0.01)。與外周不同的是，IL-6在Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠斑塊局部mRNA水平較對照組降低(p＜0.05)，而TGF-β較對照組升高(p＜0.001)，其他細胞因子沒有明顯差別。已知IL-6和IL-17是促炎性細胞因子，具有促進動脈粥樣硬化斑塊形成的作

30、用;而IL-10和TGF-β是抑炎性細胞因子，具有抑制斑塊形成的作用。故PDCD4缺失導(dǎo)致的細胞因子譜的改變可能是PDCD4缺失導(dǎo)致斑塊減少的另一個機制。
　　 4.體外實驗研究PDCD4對T細胞功能的影響及其機制
　　 (1)PDCD4缺失導(dǎo)致CD8+T細胞增殖能力降低
　　 明確了PDCD4對T細胞亞群數(shù)量的影響，為了進一步明確其對T細胞功能的影響，我們?nèi)?6周Pdcd4-/-Apoe-/-和Apoe-/-小

31、鼠的脾臟，制備脾細胞的單細胞懸液進行體外培養(yǎng)，并用CD3抗體刺激T細胞活化。然后用CCK8試劑盒檢測培養(yǎng)3天后T細胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠脾細胞增殖能力較對照組明顯減弱(p＜0.001)，而用流式細胞儀檢測CD4+和CD8+T細胞亞群比例發(fā)現(xiàn)，CD4+T細胞增殖情況無明顯差別，而Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠CD8+T細胞增殖后比例較對照組明顯減少(p＜0.05)，說明PDCD4缺失降低了CD8+T細胞的

32、增殖能力。
　　 因為T細胞的活化增殖除了抗原提供第一信號外，必須通過協(xié)同刺激分子傳遞第二信號，所以為了明確CD8+T細胞增殖能力的減弱是否由于協(xié)同刺激分子表達的改變所致，我們用流式細胞儀檢測了CD4+和CD8+T細胞協(xié)同刺激分子（CD28和CD137）和協(xié)同抑制分子(CTLA-4)的表達，結(jié)果顯示提供活化信號的CD28和CD137在CD4+T細胞上的表達兩種小鼠無明顯差別，而在CD8+T細胞上的表達Pdcd4-/-Apoe-/

33、-小鼠較對照組均明顯下降(p＜0.05);提供抑制信號的CTLA-4在CD4+和CD8+T細胞上的表達均較對照組升高(p＜0.05)。以上結(jié)果提示，Pdcd4缺失引起的CD8+T細胞增殖能力及數(shù)量的降低可能由于CD8+T細胞上協(xié)同刺激分子CD28和CD137表達下調(diào)，而協(xié)同抑制分子CTLA-4表達上調(diào)導(dǎo)致的。
　　 (2)PDCD4缺失導(dǎo)致T細胞分泌IL-17減少
　　 我們用流式細胞微球芯片試劑盒檢測T細胞培養(yǎng)上清中細

34、胞因子的分泌情況，發(fā)現(xiàn)Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠T細胞分泌的IL-17較對照組明顯下降(p＜0.05)，而其他細胞因子均無明顯差別，這與之前血清中IL-17濃度的改變趨勢是一致的，提示IL-17濃度的降低可能是PDCD4缺失減弱動脈粥樣硬化發(fā)展的原因之一。
　　 5.體外實驗發(fā)現(xiàn)PDCD4缺失導(dǎo)致巨噬細胞產(chǎn)生高水平的IL-10
　　 我們進一步在體外研究了PDCD4對巨噬細胞功能的影響，收集C57BL/6和Pdc

35、d4-/-小鼠的腹腔巨噬細胞體外培養(yǎng)，并用oxLDL模擬體內(nèi)高脂環(huán)境刺激其活化。分別取刺激6、12、24和48h培養(yǎng)上清，ELISA的方法檢測巨噬細胞分泌的細胞因子IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β的濃度，結(jié)果顯示，除了TGF-β在兩種小鼠中無明顯差別之外，其余3種細胞因子均為Pdcd4-/-小鼠較對照組升高，但是IL-6和TNF-α濃度在12h達到高峰以后，隨時間延長逐漸降低，而IL-10濃度隨時間延長持續(xù)增加，所以IL-1

36、0的抑炎作用可能占主導(dǎo)地位。
　　 6.體內(nèi)干預(yù)治療確定IL-10的上調(diào)是PDCD4缺失導(dǎo)致斑塊減少的主要原因
　　 在我們前期實驗研究中，給Apoe-/-小鼠注射重組細胞因子IL-17可以明顯加重斑塊的發(fā)展。為了探討PDCD4缺失引起的IL-17下降和IL-10增多是否是動脈粥樣硬化斑塊減小的主要原因，我們采用同樣的處理方法，將Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠分為3組，分別在高脂喂養(yǎng)5周后腹腔注射生理鹽水、重組IL-

37、17細胞因子和IL-10中和性抗體，每周一次，共注射5周，并以Apoe-/-小鼠注射生理鹽水做為正常對照。主動脈根部制備冰凍切片，HE和油紅O染色比較斑塊的大小，結(jié)果顯示注射IL-17組較注射生理鹽水組斑塊面積無明顯差異，而注射IL-10中和性抗體組較生理鹽水組斑塊面積明顯增加(p＜0.05)。以上結(jié)果提示，PDCD4缺失引起的IL-10增多是其減弱動脈粥樣硬化斑塊的主要機制。
　　 7.分子機制研究證明PDCD4主要在轉(zhuǎn)錄水平

38、發(fā)揮對IL-10的負調(diào)控作用
　　 為了探討PDCD4是否在翻譯水平調(diào)控IL-10的表達，首先采用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA-BindingProteinImmunoprecipitation，RIP）的方法檢測活化的巨噬細胞中PDCD4是否與具有5'UTR二級結(jié)構(gòu)的IL-10mRNA形成復(fù)合體從而抑制IL-10的翻譯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCD4與IL-10mRNA不結(jié)合，即PDCD4不影響IL-10的翻譯，故我們認為PDCD4是從

39、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控IL-10的表達。
　　 然后，我們從mRNA水平研究PDCD4對IL-10表達的調(diào)控。分別取刺激3、6和12h的巨噬細胞提取其RNA，用RT-PCR的方法檢測IL-10在mRNA水平的表達，發(fā)現(xiàn)Pdcd4-/-巨噬細胞產(chǎn)生的IL-10在mRNA水平上的表達明顯較對照組升高，提示PDCD4在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)IL-10的表達。為了明確PDCD4的缺失通過改變了哪條信號傳導(dǎo)通路從而增加了IL-10的轉(zhuǎn)錄，我們用western

40、blot的方法檢測了分別刺激6、12和24h的巨噬細胞產(chǎn)生IL-10的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路（MAPK通路）分子的表達情況，結(jié)果顯示磷酸化活化的JNK在兩種小鼠中無明顯差別，而ERK1/2和P38的磷酸化活化在Pdcd4-/-小鼠中較對照組明顯升高。為了明確這兩條通路的作用，我們在刺激巨噬細胞活化的同時分別添加ERK1/2和P38抑制劑，結(jié)果IL-10產(chǎn)生明顯下降。以上結(jié)果提示Pdcd4缺失可能通過增加ERK1/2和P38的磷酸化活化從而導(dǎo)致IL

41、-10的產(chǎn)生增加。
　　 結(jié)論
　　 1.PDCD4在動脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展過程中表達上調(diào)。
　　 2.Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠斑塊面積減小，斑塊局部巨噬細胞和T細胞浸潤減少。
　　 3.通過骨髓移植實驗證實了免疫細胞在PDCD4缺失減弱動脈粥樣硬化的過程中起主要作用。
　　 4.外周和斑塊局部CD8+T細胞比例減少，而Treg比例升高;促炎性細胞因子IL-17濃度降低，而抑炎性細胞

42、因子IL-10濃度增加。
　　 5.PDCD4缺失CD8+T細胞增殖能力下降，可能是通過下調(diào)協(xié)同刺激分子CD28和CD137，而上調(diào)協(xié)同抑制分子CTLA-4實現(xiàn)的。
　　 6.PDCD4缺失巨噬細胞分泌IL-10增加。
　　 7.體內(nèi)試驗證明IL-10增加是PDCD4缺失后斑塊減小的主要原因。
　　 8.PDCD4不影響IL-10的翻譯，可能是通過ERK和P38通路從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控IL-10的表達。

43、　　 創(chuàng)新性和研究的意義
　　 1.首次證明抑癌基因PDCD4具有促進動脈粥樣硬化發(fā)生的作用:我們發(fā)現(xiàn)Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過程中PDCD4表達上調(diào)，Pdcd4-/-Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積減小。本研究為以PDCD4為靶點臨床治療動脈粥樣硬化提供了理論基礎(chǔ)和實驗根據(jù)。
　　 2.通過骨髓移植實驗確定了免疫細胞在PDCD4影響動脈粥樣硬化中的作用。首次提出PDCD4可引起巨噬細胞和T細胞亞群

44、數(shù)量和功能的改變。
　　 3.我們通過體內(nèi)試驗證明了PDCD4缺失導(dǎo)致的IL-10增加是Pdcd4敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊減弱的主要原因。發(fā)現(xiàn)PDCD4不影響IL-10的翻譯水平，而是通過ERK和P38通路從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控IL-10的表達;此研究不僅明確了PDCD4影響動脈粥樣硬化的作用機制，而且為動脈粥樣硬化的治療提供了新的靶點。局限性
　　 1.由于技術(shù)的限制，本論文僅使用敲基因小鼠做為研究對象，沒有在PDCD4過表達