精氨酸酶Ⅰ在動脈粥樣硬化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 炎癥是動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生、發(fā)展過程中的一個重要因素，炎癥的發(fā)生常常關(guān)系到動脈粥樣硬化的進(jìn)程、嚴(yán)重程度及其后果。炎性因子的分泌能夠引起單核、巨噬細(xì)胞的趨化、遷移，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。血管平滑肌細(xì)胞位于血管壁的中層，在正常的生理狀態(tài)下這些細(xì)胞通常是“安靜”的，表現(xiàn)出一種分化狀態(tài)來維持血管的結(jié)構(gòu)及其緊張度。然而，在某些條件下（如動脈粥樣硬化形成），血管平滑肌細(xì)胞獲得了一種“分泌”型的表型，表現(xiàn)為去分化狀態(tài)

2、，并能夠合成、分泌一些炎性因子，從而促進(jìn)了血管的病變過程。
　　 精氨酸酶Ⅰ(ArgⅠ)能夠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖，但其在炎癥反應(yīng)中的作用還未明確。L-精氨酸是精氨酸酶(Arginase)和一氧化氮合成酶(NOS)的共同催化底物。在炎癥反應(yīng)中，iNOS能夠產(chǎn)生過量的一氧化氮(N0)，通過與細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子（02.-）反應(yīng)產(chǎn)生有致炎作用的ON00-。因此，減少iNOS的底物有助于抑制細(xì)胞內(nèi)的炎癥。
　　 在以往研究的基礎(chǔ)上

3、，我們提出如下假設(shè):1）精氨酸酶Ⅰ具有抑制細(xì)胞內(nèi)炎癥作用;2）精氨酸酶Ⅰ抑制炎癥的作用是通過與iNOS競爭底物實現(xiàn)的。本研究正是基于以上思路，擬通過體外和體內(nèi)兩部分實驗以驗證這一假說。
　　 旨在探討ArgⅠ在平滑肌細(xì)胞(SMC)炎癥反應(yīng)中的作用，以期尋找到與SMC相關(guān)的炎癥性疾病的預(yù)防和治療靶點。
　　 材料與方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立:
　　 采用人主動脈平滑肌細(xì)胞(hASMCs)作為研究對

4、象;體外以脂多糖(LPS)作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)hASMCs發(fā)生炎癥反應(yīng)。
　　 2.細(xì)胞內(nèi)ArgⅠ干預(yù):
　　 采用瞬時轉(zhuǎn)染ARGI-pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和si-ARGI小干擾片段的方式實現(xiàn)對hASMCs細(xì)胞內(nèi)ArgI的干預(yù)。
　　 3.動物模型的建立及干預(yù):
　　 新西蘭大白兔采用腹主動脈球囊拉傷+高脂喂養(yǎng)的方式建立動脈粥樣硬化斑塊模型，于喂養(yǎng)12周后按照本實驗室建立的斑塊內(nèi)注射的方法對斑塊進(jìn)行ARGI

5、過表達(dá)及小干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染，繼續(xù)喂養(yǎng)四周后將動物實施安樂死后取材。
　　 4.采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA):
　　 檢測平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)中的腫瘤壞死因子α(TNFα)的含量;
　　 5.實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Real-timeRT-PCR)、Western-blot及酶活性檢測法:分別檢測精氨酸酶Ⅰ(ArgⅠ)和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)的基因表達(dá)水平、蛋白質(zhì)表達(dá)水平及酶活性變化。
　　 6.單

6、核細(xì)胞趨化及遷移檢測:
　　 采用Transwell小室構(gòu)建了人單核細(xì)胞(THP1)與hASMCs的共培養(yǎng)體系，檢測單核細(xì)胞的趨化及遷移能力。
　　 7.細(xì)胞熒光免疫組化及組織熒光免疫組化:
　　 顯示細(xì)胞內(nèi)的ArgⅠ、iNOS、NF-κB的P65亞基、斑塊內(nèi)細(xì)胞成分及TNFα的表達(dá)。
　　 8.流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦顯微技術(shù):
　　 分別檢測細(xì)胞內(nèi)過氧亞硝基(ON00-)、活性氧簇(ROS)及超

7、氧陰離子(02.-)的含量。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.LPS對hASMCs細(xì)胞內(nèi)TNFα產(chǎn)生的誘導(dǎo)具有時間-劑量依賴性:LPS(＞10ng/ml)能夠誘導(dǎo)hASMCs細(xì)胞內(nèi)TNFα的釋放，且TNFα釋放量隨LPS刺激劑量增加或時間延長而增大。細(xì)胞受LPS刺激后能引起TNFα的快速釋放，但刺激超過24小時，其TNFα釋放量增加幅度有所減小;刺激超過48小時，其增加幅度減小更加明顯。
　　 2.LPS通過激活iN

8、OS增加入主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)TNFα的表達(dá)量:
　　 LPS能夠誘導(dǎo)hASMCs細(xì)胞TNFα的釋放，但加入iNOS抑制劑(AG或1400W)后，此過程被抑制，TNFα的分泌量減少大約70～80％，證明LPS通過激活iNOS增加入主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)TNFα的表達(dá)量。
　　 3.LPS能夠同時上調(diào)入主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)ArgⅠ和iNOS的表達(dá):
　　 細(xì)胞在LPS的刺激下，無論基因還是蛋白水平ArgⅠ和iNOS均隨LP

9、S刺激而升高，但ArgⅠ的升高速度落后于iNOS。iNOS的mRNA水平在8小時達(dá)到高峰，而ArgⅠ的mRNA水平在12小時達(dá)到高峰，之后二者的增幅出現(xiàn)回落;在蛋白表達(dá)水平，iNOS在LPS的刺激下表現(xiàn)為持續(xù)升高，而ArgⅠ在LPS刺激超過48小時后其蛋白水平開始下降。
　　 4.ArgⅠ與iNOS之間存在底物競爭:
　　 與上述趨勢一致的是，兩種酶的催化活性也隨LPS刺激而升高。但與NOS活性持續(xù)升高不同的是，精氨酸酶

10、活性在48小時后明顯下降。而且，當(dāng)精氨酸酶活性降低時，NOS活性反而有小幅升高。在預(yù)先向培養(yǎng)基中加入二者的共同底物L(fēng)-精氨酸后，兩種酶的催化活性在LPS作用12小時后均有所增加，這種升高趨勢一直持續(xù)至72小時。
　　 5.ArgⅠ能夠抑制TNFα的生成和單核細(xì)胞的趨化和遷移:
　　 精氨酸酶Ⅰ能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的入主動脈平滑肌細(xì)胞TNFα的釋放，而精氨酸酶Ⅰ抑制或干擾則能加劇TNFα的釋放。經(jīng)LPS誘導(dǎo)后的入主動脈平

11、滑肌細(xì)胞，單核細(xì)胞向其趨化和遷移的能力明顯增加。而提高精氨酸酶Ⅰ的表達(dá)則能降低單核細(xì)胞的這種趨化和遷移能力，反之，則加劇單核細(xì)胞的遷移和趨化能力的增加。
　　 6.ArgⅠ通過與iNOS競爭共同的催化底物來抑制平滑肌細(xì)胞NO的釋放:
　　 免疫組化結(jié)果顯示在入主動脈平滑肌細(xì)胞中精氨酸酶Ⅰ和iNOS在空間上存在很大程度的共定位;升高精氨酸酶Ⅰ能夠加劇LPS誘導(dǎo)的NO的釋放，而抑制或干擾精氨酸酶Ⅰ的表達(dá)，則能逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象;但

12、升高精氨酸酶Ⅰ卻未能對iNOS的表達(dá)量造成影響，提示精氨酸酶Ⅰ通過與iNOS競爭共同的催化底物L(fēng)-精氨酸來抑制NO的釋放，而非通過減少iNOS的表達(dá)量。
　　 7.ArgⅠ能夠減少入主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)ROS、02.-以及ON00-的生成:增加入主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)的精氨酸酶Ⅰ表達(dá)能夠抑制LPS對細(xì)胞內(nèi)ROS、02.-及ON00-的生成的誘導(dǎo);抑制iNOS的活性同樣能夠抑制細(xì)胞內(nèi)02.-及ON00-的生成增加，而未能對ROS的生成產(chǎn)

13、生明顯影響。
　　 8.ArgⅠ通過抑制NF-kB的激活降低TNFα的生成:
　　 LPS能夠引起NF-κB的激活，而后者的激活則能引起細(xì)胞內(nèi)TNFα的生成。精氨酸酶Ⅰ過表達(dá)能夠通過抑制NF-kB的激活降低TNFα的生成。
　　 9.ArgⅠ能夠降低動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng):
　　 局部轉(zhuǎn)染精氨酸酶Ⅰ過表達(dá)慢病毒載體能夠引起斑塊內(nèi)TNFα、iNOS的表達(dá)量及巨噬細(xì)胞含量的降低，而抑制精氨酸酶Ⅰ則起到相

14、反的效果。TNFα與SMC的面積比計算結(jié)果顯示，精氨酸酶Ⅰ能夠明顯地降低該比值。
　　 結(jié)論及意義：
　　 1.精氨酸酶Ⅰ具有抑制SMC炎癥的作用;
　　 2.精氨酸酶Ⅰ具有抑制動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)炎癥的作用;
　　 3.精氨酸酶Ⅰ的抑炎作用通過與具有促炎作用的iNOS競爭底物，減少了后者催化產(chǎn)物的生成量，從而減少ON00-的生成，進(jìn)而起到抑制炎癥的作用。
　　 4.在本實驗研究中，我們對ArgⅠ在