減阻劑對大鼠慢性缺血后肢骨骼肌血流灌注的影響.pdf

1、背景:周圍血管疾病(Pedpheral arterial disease,PAD)是一類臨床常見疾病,由于粥樣硬化斑塊、血栓、動脈炎癥等原因造成的動脈狹窄或閉塞,發(fā)病機(jī)理包括血液微循環(huán)、流變學(xué)、血小板功能、凝血機(jī)制、免疫、代謝等方面的異常。大血管狹窄或閉塞后,其供血區(qū)的骨骼肌發(fā)生缺血損傷,進(jìn)而導(dǎo)致靜息痛、間歇性跛行、肢體壞疽等一系列臨床癥狀。目前治療方法包括溶栓、外科手術(shù)、介入取栓等,可以起到開通大血管的作用,而對于大血管閉塞后微循環(huán)的

2、損傷缺少良好的治療手段。治療性血管新生是通過人為的向局部缺血組織輸送血管生長因子、基因或重組蛋白的方式促進(jìn)血管新生,從而改善缺血組織的缺血缺氧狀態(tài)[1-3]。近年來該研究取得了一定的成果,但是這類生長因子在誘導(dǎo)血管再生的過程中,其不可控的促血管再生效應(yīng)可能出現(xiàn)許多并發(fā)癥[4,5],目前臨床應(yīng)用仍很局限。那么,尋找其他的治療手段就顯得很有意義了。
　　 血管發(fā)生(neovascularization)包含血管新生(angiogen

3、esis)和小動脈形成(arteriogenesis)[2]。血管新生的驅(qū)動因素是缺氧,而動脈形成的始動因素是血流切應(yīng)力(fluid shear stress,FSS)的增加[6]。豬急性股動脈閉塞的模型中,在閉塞遠(yuǎn)端造成人工動-靜脈瘺,發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)更多側(cè)支循環(huán)的建立,局部血運狀態(tài)的改善情況明顯優(yōu)于促血管生長因子的作用[7]。表明持續(xù)增加缺血組織的血流切應(yīng)力能明顯促進(jìn)局部小動脈形成。那么,能否通過增加血流剪切力促進(jìn)小動脈形成來治療缺血性疾

4、病呢?
　　 1948年英國科學(xué)家Toms報導(dǎo)了Toms現(xiàn)象(Toms phenomenon)[8],他發(fā)現(xiàn)一類特殊可溶性高分子聚合物,它可以在不影響流體粘滯度的同時明顯減少管道液體的流動阻力,這類高分子聚合物被稱為“減阻劑”(Drag-reducingpolymers,DRPs)。至今,減阻劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究、石油、消防、灌溉、航海等領(lǐng)域。
　　 近年來減阻劑在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域倍受關(guān)注,已先后證明減阻劑具有改善急性心肌缺

5、血動物預(yù)后、改善失血性休克微循環(huán)灌注、改善糖尿病動物微循環(huán)障礙等方面的作用,并能通過增加血流剪切力的作用減少動脈粥樣硬化斑塊的形成。表明減阻劑在缺血性心血管疾病、失血性休克、動脈粥樣硬化等循環(huán)系統(tǒng)疾病的治療方面有很大的發(fā)展前景。我課題組證實PEO能促進(jìn)大鼠急性后肢缺血骨骼肌血流灌注的恢復(fù)[11],并直接觀察到PEO可提高微動脈血管壁的切應(yīng)力30％[12],表明DRPs可以提高缺血組織的血供狀況,為急性缺血疾病治療提供新的思路,并為進(jìn)一探

6、討DRPs恢復(fù)慢性缺血組織血供提供了基礎(chǔ),但是目前除了減阻劑干預(yù)動脈粥樣硬化斑塊形成的研究外,減阻劑的研究都局限于急性血管閉塞、狹窄或失血性休克等狀態(tài)血流動力學(xué)的改變,而慢性缺血性疾病的研究尚未見報道,能否利用PEO增加血流剪切力的作用來治療缺血性疾病呢?
　　 本實驗擬通過超聲造影方法測定微循環(huán)血流量,觀察PEO對外周動脈完全閉塞情況下慢性缺血骨骼肌微循環(huán)灌注的影響,并探討減阻劑通過提高血流剪切力促進(jìn)缺血組織動脈生長(arte

7、riogenesis)的可能性。
　　 第一部分:對比超聲定量大鼠后肢骨骼肌絕對血流量的研究
　　 [目的]建立“應(yīng)用對比超聲技術(shù)定量大鼠骨骼肌絕對血流量”的方法學(xué),并評價該方法的穩(wěn)定性及可重復(fù)性。
　　 [方法]
　　 1.動物準(zhǔn)備:SPF級Wistar雄性大鼠12只,3％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,大鼠心前區(qū)及左側(cè)后肢備皮,仰臥固定于鼠板上。
　　 2,超聲造影劑全氟丙烷人血白蛋白微泡注射劑(“

8、全氟顯”),濃度約為(1.0～2.0)×109/ml,微泡大小2.0～4.0μm,實驗時以0.9％氯化鈉注射液3ml稀釋并搖勻待用。
　　 3.造影方法:使用Sequoia512超聲診斷儀(17L5探頭),將探頭定位在左室短軸切面,通過輸液泵持續(xù)滴注造影劑“全氟顯”(20μl/min)達(dá)穩(wěn)態(tài)濃度后,以對比脈沖序列模式(Coherent Pulse Sequence,CPS),R波觸發(fā)間歇成像取圖；再將超聲探頭定位在大鼠后肢中部(

9、髕骨和踝關(guān)節(jié)連線中點),參數(shù)保持不變,以時間觸發(fā)(間隔500ms)成像,當(dāng)靜注造影劑(200μl/min)至充盈達(dá)穩(wěn)態(tài)穩(wěn)定后,以高機(jī)械指數(shù)破壞造影劑微泡后開始存取骨骼肌組織內(nèi)造影劑再充填過程的全部圖像。
　　 7天后按照上述的實驗步驟再重復(fù)一次造影。
　　 4.骨骼肌血流量的計算方法造影圖像脫機(jī)使用MCE分析軟件(OHSU,USA)分析,測定左室心腔造影穩(wěn)態(tài)時的平均聲學(xué)強(qiáng)度ALV,骨骼肌造影的聲學(xué)平臺強(qiáng)度Am及造影劑再填

10、充速率βm。大鼠骨骼肌肌肉密度ρm=1.05g/ml,本實驗中骨骼肌造影所用造影劑濃度為心腔造影所用濃度的10倍,故大鼠骨骼肌的絕對血流量為60×βm×Am/(ALV×10)/1.05(單位:ml·g-1·min-1)。
　　 [結(jié)果]經(jīng)靜脈注射“全氟顯”后,大鼠心腔和后肢骨骼肌均獲得滿意的顯像效果。同一只大鼠先后兩次造影得出的骨骼肌毛細(xì)血管容積,血流速度及標(biāo)化計算后的骨骼肌的血流量統(tǒng)計學(xué)上未見顯著性差異(P>0.05)。超聲造

11、影定量血流參數(shù)曲線的擬合優(yōu)度良好,決定系數(shù)為0.944±0.046(0.789～0.985),P<0.01。
　　 [結(jié)論]以左室腔聲學(xué)造影強(qiáng)度為參照行聲學(xué)造影檢查能準(zhǔn)確定量大鼠后肢骨骼肌的絕對血流量,該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,可視為一種在活體定量肌肉組織絕對血流量的新方法。
　　 第二部分:減阻劑對大鼠慢性缺血后肢骨骼肌血流灌注的影響
　　 [目的]建立大鼠慢性后肢骨骼肌缺血模型,通過靜脈給予藥物治療,應(yīng)

12、用超聲造影方法測量大鼠后肢骨骼肌的血流量變化及應(yīng)用免疫組化方法研究血管的變化,評價減阻劑對大鼠慢性缺血后肢骨骼肌血流灌注的影響,并初步探索減阻劑增加血流灌注的機(jī)理,為構(gòu)建缺血性疾病新的治療手段奠定基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.減阻劑的配制方法:PEO溶解于生理鹽水中成0.1％的濃度,放置于分子截留量為50KDa的透析袋中透析24小時,使用小過濾器(孔徑0.21am)將溶液中的細(xì)菌濾除后,用凝膠滲透色譜法測定溶液中PE

13、O的分子量為4.99×106Da,,生理鹽水稀釋成50ppm的濃度待用。
　　 2.大鼠輸液通道的建立:麻醉狀態(tài)下分離頸靜脈,插入靜脈留置導(dǎo)管,將導(dǎo)管用縫線在皮下多處固定后,經(jīng)皮下隧道引導(dǎo)至背部切口并固定。大鼠分籠飼養(yǎng),每日予0.1ml肝素生理鹽水(10 iu/ml)沖管。
　　 3.大鼠單側(cè)后肢慢性缺血模型的建立:輸液通道建立后3天,3％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。沿大鼠右側(cè)后肢腹股溝韌帶下緣做一1cm長切口,分離右股動脈

14、及其分支剝離并以5—0細(xì)絲線結(jié)扎后切斷,避免傷及靜脈及神經(jīng),左側(cè)后肢不做處理。
　　 4.給藥方法:將大鼠隨機(jī)分成兩組,于缺血后第1、3、5、7、9、11、13天清醒自由活動狀態(tài)下通過輸液通道給藥,治療組予減阻劑(30min,給藥速度以體重計算血容量,使血中PEO濃度達(dá)到2μg/ml),對照組予以相同的速度相同時間給予生理鹽水,治療結(jié)束后予0.1ml肝素鹽水(10iu/ml)沖管,小鋼絲封閉輸液導(dǎo)管。
　　 5.聲學(xué)造影

15、評價大鼠后肢骨骼肌血流:于術(shù)前及術(shù)后第1、3、7、14、21、28天行聲學(xué)造影檢查,方法同第一部分。
　　 6.血流儲備檢測:于第28天行平靜狀態(tài)下聲學(xué)造影檢測后,持續(xù)滴注“全氟顯”(200μl/min),造影模式和參數(shù)不變,使用臨時起搏器刺激大鼠后肢骨骼肌(頻率為120次/分)2分鐘后,開始取圖。脫機(jī)使用MCE軟件分析圖像,記錄A、β及A×β值。血流儲備即為起搏后的A×β值與起搏前的A×β值的比值。
　　 7.病理學(xué)檢

16、測:第28天行超聲造影后予較大量的麻藥處死動物,行HE染色及α-actin抗體免疫組化染色。
　　 [結(jié)果]
　　 4周后,減阻劑治療組大鼠缺血后肢的血流量顯著高于鹽水對照組(0.319±0.044 vs0.211±0.040 ml/g/min,P=0.001):減阻劑治療組慢性缺血后肢的血流儲備亦高于鹽水對照組(3.227±0.941 vs1.867±0.551,P=0.012);減阻劑組大鼠后肢缺血的骨骼肌血管容積較

17、生理鹽水組比較有顯著增加(0.446±0.111 vs0.310±0.059,P=0.024)；HE染色提示:大鼠非缺血后肢骨骼肌細(xì)胞形態(tài)正常,無充血、水腫,鹽水組及減阻劑組的缺血骨骼肌中均有炎癥細(xì)胞浸潤,鹽水組骨骼肌細(xì)胞可見水腫,而減阻劑組的細(xì)胞未見明顯水腫；免疫組化提示減阻劑組的每高倍鏡下小動脈個數(shù)較鹽水組的多(9.25±1.72 vs6.23±0.86,P=0.026)。
　　 [結(jié)論]
　　 減阻劑能增加大鼠慢性