干細胞移植對糖尿病后肢缺血大鼠骨骼肌中生長因子表達影響的初步研究.pdf

1、目的：隨著社會的發(fā)展和進步，人們生活水平的不斷提高和生活方式的改變，糖尿病患病率在我國乃至全世界范圍內(nèi)呈逐漸上升趨勢。糖尿病久病可引起眼、腎臟、神經(jīng)、血管等并發(fā)癥，截至目前為止，關(guān)于糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病的研究，國內(nèi)外報道的很多，但關(guān)于糖尿病的骨骼肌病變，國內(nèi)外研究的較少。骨骼肌是全身利用葡萄糖最重要的組織之一，也是高血糖損害的主要靶位，高血糖和下肢缺血兩個因素共同引起糖尿病下肢骨骼肌病變。近年來，生長因子在骨骼肌生長發(fā)育、肌肉內(nèi)

2、血管生成及肌肉損傷后修復中的作用受到了越來越廣泛的重視。
　　 隨著干細胞研究的進展以及分離、純化干細胞方法的不斷改進，使采用干細胞治療等治療性血管生成方法在缺血部位重建有效的側(cè)支循環(huán)成為可能，目前臨床上證實自體外周血干細胞移植術(shù)是一種較好的治療糖尿病下肢骨骼肌病變的方法。
　　 本研究通過給雄性SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）復制1型糖尿病大鼠模型，后結(jié)扎股動脈并離斷制造糖尿病后肢缺血

3、模型來復制糖尿病大鼠后肢骨骼肌病變模型，通過對部分大鼠實施自體外周血干細胞移植術(shù)，觀察自體外周血干細胞移植術(shù)對后肢腓腸肌中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）表達的影響，探討自體外周血干細胞移植術(shù)對糖尿病大鼠骨骼肌病變改善的情況，從而為臨床上實施干細胞移植治療糖尿病骨骼肌病變提供

4、理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、糖尿病大鼠模型的制備
　　 健康Sprague-Dawlay（SD）雄性大鼠45只，適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為3組：正常對照組（A組）15只、糖尿病后肢缺血組（B組）15只、糖尿病后肢缺血后干細胞移植組（C組）15只。對B、C兩組大鼠，空腹12小時后給予腹腔注射STZ65mg/kg復制1型糖尿病模型，注射STZ72小時后測血糖，以血糖大于16.65mmol/L定為造模成功。

5、>　　 2、糖尿病大鼠后肢缺血模型的制備
　　 糖尿病造模成功后7天對糖尿病大鼠實施雙后肢股動脈結(jié)扎并離斷造成糖尿病大鼠后肢缺血模型，后為預防傷口感染，每天給予肌肉注射青霉素4萬單位/只，共3天。在實驗過程中，B組大鼠死亡2只，C組大鼠死亡1只。
　　 3、干細胞動員
　　 在糖尿病后肢缺血造模成功后第7天，C組大鼠開始每天給予皮下注射粒細胞集落刺激因子G-CSF15μg/kg，連用3天，給藥后第3天采集各組大

6、鼠內(nèi)眥靜脈血進行白細胞數(shù)值監(jiān)測。
　　 4、實施自體外周血干細胞移植術(shù)
　　 C組大鼠每只心臟采血5ml，加入抗凝管中，與Hank’s液1：1混勻后，小心加于10ml的細胞分離液之液面上，以2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，收集界面上的細胞，放入含Hank’s液20-25ml的試管中，充分混勻后，以1500-2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，吸去上清液，沉淀經(jīng)反復洗2次即得所需細胞。用1ml無菌注射器抽取細胞，制成5×108/ml的

7、細胞懸液，分別在C組每只大鼠左下肢腓腸肌處多點肌肉注射。
　　 5、標本收集
　　 干細胞移植后4周心臟采血，后處死大鼠，并留取每只SD大鼠后肢腓腸肌中段肌肉各0.5cmX0.5cmX0.3cm，分別置于10％的福爾馬林中保存，待行HE染色觀察三組病理結(jié)果，行免疫組織化學染色測定后肢腓腸肌中VEGF及bFGF的表達情況。
　　 6、觀察指標
　　 6.1血糖的測定
　　 血糖用葡萄糖氧化酶法測定。

8、測定步驟：準備3只試管：空白管、標準管、測定管，均加入酶、酚試劑各1.5ml，標準管加入標準液0.02ml，待測管加入待測樣本0.02ml，混勻后于37℃保溫15分鐘，以空白管調(diào)零，測定各管吸光度值。測定參數(shù)：波長505nm，溫度37℃。
　　 6.2外周血白細胞的測定
　　 取大鼠內(nèi)眥靜脈血1ml，利用流式細胞檢測儀進行白細胞計數(shù)。
　　 6.3腓腸肌組織形態(tài)學檢查
　　 常規(guī)方法制備大鼠腓腸肌光鏡切片

9、，行HE染色，鏡檢。
　　 6.4腓腸肌中VEGF和bFGF蛋白表達
　　 常規(guī)方法行大鼠腓腸肌免疫組織化學染色測定下肢腓腸肌中VEGF和bFGF的表達情況。
　　 6.5鏡檢：
　　 在光鏡下觀察各組骨骼肌形態(tài)學，每組選擇50張切片在高倍鏡下觀察VEGF和bFGF蛋白的表達，VEGF和bFGF為胞漿著色，陽性細胞染成棕黃色，以不表達定為（-），低度表達定為（+），中度表達定為（++），強表達定為（+++

10、）。
　　 7、統(tǒng)計學處理
　　 所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗進行比較，兩組以上比較采用單因素方差分析作統(tǒng)計學處理。各組間VEGF和bFGF表達的比較用非參數(shù)檢驗，檢驗的顯著性用P值表示。P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1、糖尿病造模后3日后大鼠出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿癥狀，隨后體重明顯下降；

11、B組大鼠在結(jié)扎股動脈后出現(xiàn)趾端顏色蒼白、皮溫下降。干細胞移植后4周，C組大鼠左后肢趾端顏色蒼白較右后肢有所緩解，皮溫有所升高，C組大鼠左后肢皮溫與A組相比仍有所下降。
　　 2、血糖：糖尿病模型造模成功后，B組血糖明顯高于A組，有顯著性差異（P<0.05），C組血糖明顯高于A組，有顯著性差異（P<0.05），B組血糖跟C組相比無顯著性差異（P>0.05）。
　　 3、外周血白細胞的測定
　　 干細胞動員后第3天，

12、C組血白細胞明顯高于A組，有顯著性差異（P<0.05），C組血白細胞明顯高于B組，有顯著性差異（P<0.05），A組血白細胞跟B組相比無顯著性差異（P>0.05）。
　　 4組織學觀察A組骨骼肌表現(xiàn)為正常的組織結(jié)構(gòu)。C組左后肢骨骼肌可見細胞胞漿濃縮，核固縮，肌纖維部分區(qū)域斷裂。B組骨骼肌及C組右后肢骨骼肌表現(xiàn)為普遍性萎縮，肌纖維變性壞死，核固縮，橫紋模糊消失，間質(zhì)脂肪組織增生。
　　 5、bFGF和VEGF蛋白表達的變化

13、
　　 A組骨骼肌可見bFGF表達，陽性細胞呈棕黃色。C組及B組骨骼肌bFGF表達減弱，與A組相比有顯著性差異（P<0.05）。C組左后肢骨骼肌bFGF表達比B組有所上升，兩者相比有顯著性差異（P<0.05）。
　　 A組骨骼肌均未見VEGF表達，C組及B組骨骼肌可見VEGF表達，B組骨骼肌VEGF表達明顯低于C組，兩者相比有顯著性差異（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1、給予大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素

14、及結(jié)扎后肢股動脈可制造大鼠糖尿病骨骼肌病變模型。
　　 2、正常骨骼肌表達bFGF，缺血可誘導骨骼肌中bFGF的表達減少，自體外周血干細胞移植可以緩解缺血誘導的骨骼肌中bFGF表達減少，從而增加了糖尿病后肢缺血大鼠的后肢血管新生，從而改善糖尿病骨骼肌病變。
　　 3、正常骨骼肌不表達VEGF，缺血可誘導骨骼肌中VEGF的表達，自體外周血干細胞移植使骨骼肌中VEGF呈高水平表達，從而緩解了糖尿病大鼠的后肢缺血情況，進而緩解